一(yī)，目(mù)的要求

1，了(liǎo)解並(bìng)掌(zhǎng)握培養(yǎng)基的配製，分(fēn)裝(zhuāng)方法

2，掌握(wò)各種(zhǒng)實驗室滅菌方法及技術

二(èr)，基本(běn)原理(lǐ)

培養(yǎng)基是供微生(shēng)物生(shēng)長，繁殖，代謝的(dí)混合養料。由於(yú)微生物具(jù)有不同(tóng)的營養類(lèi)型
，對營養(yǎng)物(wù)質的要求也各不相同(tóng)
，加之實(shí)驗和(hé)研(yán)究(jiū)的(dí)目的(dí)不(bù)同
，所以培(péi)養基的(dí)種類很多(duō)
，使用(yòng)的原料也各有(yǒu)差異
，但(dàn)從(cóng)營(yíng)養角度分析(xī)
，培養基(jī)中(zhōng)一(yī)般(bān)含有微(wēi)生物(wù)所必(bì)需的(dí)碳(tàn)源，氮源，無(wú)機鹽(yán)，生長(cháng)素以及水分(fēn)等。另外
，培養基還(huán)應(yīng)具有適(shì)宜的pH值(zhí)，一定(dìng)的緩(huǎn)衝能(néng)力，一定(dìng)的(dí)氧化(huà)還原(yuán)電(diàn)位及合(hé)適(shì)的滲透(tòu)壓。
瓊(qióng)脂是(shì)從石(shí)花(huā)菜(cài)等海藻中(zhōng)提取(qǔ)的膠體(tǐ)物質
，是應用zui廣(guǎng)的(dí)凝(níng)固劑(jì)。加(jiā)瓊脂製成的培養(yǎng)基在(zài)98～100℃下融(róng)化
，於(yú)45℃以(yǐ)下(xià)凝固。但(dàn)多(duō)次(cì)反(fǎn)復融化
，其凝(níng)固性降低(dī)。
任(rèn)何(hé)一種(zhǒng)培養基一經製成(chéng)就(jiù)應(yīng)及(jí)時*滅菌(jūn)
，以(yǐ)備純培(péi)養用。一般(bān)培養(yǎng)基(jī)的(dí)滅(miè)菌采(cǎi)用高壓蒸汽滅菌。

三，器(qì)材(cái)

1，溶液或(huò)試(shì)劑(jì)  蛋(dàn)白腖，NaCl，K2HPO4，瓊脂，NaNO3，KCl，MgSO4，FeSO4等(děng)等見培養(yǎng)基(jī)配(pèi)方。

2，儀器(qì)或(huò)其(qí)他(tā)用具(jù)  電(diàn)子天(tiān)平，高壓(yā)蒸汽滅菌鍋，稱量(liáng)紙(zhǐ)，牛角匙，精密(mì)pH試紙，量筒，刻(kè)度搪(táng)瓷杯(bēi)，試管(guǎn)，三角瓶，漏(lòu)鬥(dǒu)，分(fēn)裝(zhuāng)架，移液管及(jí)移(yí)液管(guǎn)筒(tǒng)，培養(yǎng)皿，玻(bō)璃棒，燒杯，試管架(jià)，酒精燈，電(diàn)爐等。

四(sì)，操作步驟

基(jī)本流程(chéng)：稱(chēng)藥(yào)品→溶解(jiě)→調(tiáo)pH值(zhí)→融化瓊(qióng)脂→過濾分裝→包紮標記→滅菌→擺斜麵(miàn)或(huò)倒(dǎo)平(píng)板(bǎn)。

1， 稱量藥品(pǐn)

根(gēn)據培(péi)養基配方及配製(zhì)量依次(cì)準確稱取(qǔ)各(gè)種(zhǒng)藥(yào)品(pǐn)
，放(fàng)入(rù)適當大小(xiǎo)的(dí)燒(shāo)杯中
，瓊脂(zhī)不要(yào)加入。蛋白腖極易吸潮
，故(gù)稱量時(shí)要(yào)迅速。

2，溶(róng)解(jiě)
用量筒(tǒng)取一定(dìng)量（約占(zhān)總(zǒng)量的(dí)2/3）蒸(zhēng)餾水倒(dǎo)入(rù)燒(shāo)杯中(zhōng)
，在電(diàn)爐上(shàng)小火(huǒ)加熱
，並(bìng)用玻棒攪拌(bàn)
，以(yǐ)防液體(tǐ)溢出。待各種藥品*溶(róng)解(jiě)後
，停止(zhǐ)加熱
，補足水分(fēn)。如果(guǒ)配方(fāng)中有澱粉(fěn)
，則先(xiān)將澱(diàn)粉(fěn)用少(shǎo)量冷水調(tiáo)成糊狀
，並(bìng)在火(huǒ)上加熱攪拌
，然後加(jiā)足水(shuǐ)分及(jí)其它原(yuán)料(liào)
，待(dài)*溶化(huà)後
，補足(zú)水分(fēn)。

3，調(tiáo)節(jié)pH
根據培養基(jī)對(duì)pH的要(yào)求
，用5%NaOH或(huò)5%HC1溶(róng)液調(tiáo)至(zhì)所需(xū)pH。測定pH可用(yòng)pH試(shì)紙或酸度計(jì)等。

4，溶化(huà)瓊脂
      固體或半(bàn)固體(tǐ)培(péi)養基須(xū)加入(rù)一(yī)定量(liáng)瓊(qióng)脂(zhī)。瓊脂(zhī)加入後
，置(zhì)電(diàn)爐上(shàng)一麵攪拌一麵加熱(rè)
，直(zhí)至(zhì)瓊(qióng)脂*融(róng)化後(hòu)才能(néng)停(tíng)止攪(jiǎo)拌(bàn)
，並(bìng)補足水(shuǐ)分(fēn)（水需預(yù)熱）。注意(yì)控(kòng)製(zhì)火力(lì)不(bù)要使培(péi)養(yǎng)基溢出或(huò)燒(shāo)焦(jiāo)。

5，分裝
分(fēn)裝時注意(yì)不(bù)要使培(péi)養基(jī)沾染在管(guǎn)口或瓶口
，以(yǐ)免(miǎn)引(yǐn)起汙染。液體(tǐ)分裝(zhuāng)高(gāo)度(dù)以試管(guǎn)高(gāo)度的1/4左(zuǒ)右為(wéi)宜。固體分裝裝量為(wéi)管高的(dí)1/5
，半固體分裝(zhuāng)試(shì)管一(yī)般以(yǐ)試管(guǎn)高度的1/3為(wéi)宜(yí)；分裝三角(jiǎo)瓶
，其裝量(liáng)以不(bù)超過三角瓶容積(jī)的(dí)2/3為宜。

6，包(bāo)紮標記(jì)
培養基分(fēn)裝後加好(hǎo)矽(guī)膠塞或試管(guǎn)帽(mào)。在(zài)在瓶壁或(huò)管壁上標明(míng)培養(yǎng)基(jī)名稱(chēng)
，製備組別(bié)和(hé)姓(xìng)名(míng)，日期(qī)等。

7，滅(miè)菌

培養(yǎng)基應按培養基(jī)配(pèi)方中規(guī)定(dìng)的條(tiáo)件(jiàn)及(jí)時(shí)進(jìn)行(háng)滅(miè)菌(jūn)。普通培(péi)養(yǎng)基(jī)為121℃ 20min
，以保(bǎo)證滅菌效果和(hé)不(bù)損傷培(péi)養基的(dí)有效成(chéng)份(fèn)。培養基經滅(miè)菌後(hòu)
，如需要作斜麵固(gù)體(tǐ)培養基(jī)
，則滅(miè)菌(jūn)後立(lì)即擺放成(chéng)斜麵
，斜(xié)麵長度一般(bān)以不超(chāo)過(guò)試管(guǎn)長度的1/2為宜(yí)。

7.1高壓(yā)蒸汽滅(miè)菌法
高壓蒸汽滅菌(jūn)用途(tú)廣(guǎng)
，效率(shuài)高(gāo)
，是微(wēi)生(shēng)物(wù)學(xué)實驗(yàn)中zui常用(yòng)的滅(miè)菌(jūn)方(fāng)法。這種滅菌方(fāng)法是基(jī)於(yú)水的沸(fèi)點(diǎn)隨(suí)著蒸(zhēng)汽壓力的(dí)升(shēng)高而(ér)升(shēng)高的(dí)原理設(shè)計的。當蒸汽(qì)壓力(lì)達(dá)到1.05kg/cm2時(shí)
，水(shuǐ)蒸氣(qì)的溫度升高到121℃
，經15～30min
，可全(quán)部殺死鍋(guō)內(nèi)物品上(shàng)的(dí)各種微(wēi)生(shēng)物和(hé)它們(mén)的孢子(zǐ)或芽(yá)孢(bāo)。一(yī)般(bān)培(péi)養(yǎng)基，玻璃(lí)器皿以及(jí)傳染性(xìng)標本和工(gōng)作(zuò)服等都(dū)可應用此法(fǎ)滅菌

7.2操(cāo)作(zuò)方(fāng)法和(hé)注意事項(xiàng)如(rú)下(xià) :
7.2.1  加水(shuǐ)
打開(kāi)滅(miè)菌鍋(guō)蓋(gài)
，向(xiàng)鍋內加(jiā)水(shuǐ)到(dào)水位(wèi)綫。立式消(xiāo)毒(dú)鍋(guō)用已煮開(kāi)過的水(shuǐ)
，以便減少水垢在鍋(guō)內的積(jī)存(cún)。注意水(shuǐ)要(yào)加夠(gòu)
，防止(zhǐ)滅菌過(guò)程(chéng)中幹鍋(guō)。
7.2.2  裝料，加(jiā)蓋
滅菌(jūn)材(cái)料(liào)放好(hǎo)後
，關(guān)閉滅(miè)菌(jūn)器(qì)蓋
，使(shǐ)蒸汽(qì)鍋(guō)密閉
，勿(wù)使(shǐ)漏氣。
7.2.3  排(pái)氣                                     

打開排氣口(kǒu)（也叫(jiào)放氣閥）。分別(bié)設定所需滅菌(jūn)溫度和(hé)時(shí)間(jiān)（鍋體上的定(dìng)時器為(wéi)一(yī)壓控(kòng)開(kāi)關）。接(jiē)通電源(yuán)加熱(rè)
，待(dài)水煮沸後
，水蒸氣和(hé)空氣一起從排氣孔排(pái)出(chū)
，當有大(dà)量蒸汽排出時
，維(wéi)持5min
，使鍋(guō)內冷空氣(qì)*排(pái)淨。
7.2.4  升壓(yā)，保(bǎo)壓和(hé)降壓
當鍋內(nèi)冷空氣排(pái)淨時
，即(jí)可(kě)關(guān)閉(bì)排氣(qì)閥(fá)
，壓(yā)力開(kāi)始(shǐ)上升。當(dāng)壓力(lì)上升(shēng)至所(suǒ)需壓(yā)力時
，滅菌鍋自動(dòng)控製加(jiā)熱(rè)開關(guān)以維持(chí)恒溫
，待設定時(shí)間(jiān)到達（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌(jūn)控製(zhì)在(zài)121℃
，20min）後
，自(zì)動停止(zhǐ)加熱
，待(dài)壓力降至接(jiē)近(jìn)“0”時(shí)
，打開放(fàng)氣閥。注(zhù)意(yì)不能過(guò)早(zǎo)過急地(dì)排(pái)氣(qì)
，否則會由於瓶內(nèi)壓力下降(jiàng)的速度(dù)比(bǐ)鍋(guō)內慢而造(zào)成瓶內(nèi)液(yè)體衝出容(róng)器(qì)之外(wài)。

8，無菌(jūn)檢查

將已滅菌培養(yǎng)基放(fàng)入37℃的溫室(shì)中培(péi)養(yǎng)24~48小(xiǎo)時(shí)
，以檢(jiǎn)查滅菌是否*。

本(běn)實(shí)驗分離用(yòng)培(péi)養基(jī)的配(pèi)方(fāng):

A．1/5NB培(péi)養基（各(gè)成分(fēn)取(qǔ)1/5）

    營養肉(ròu)湯(tāng)（nutrient broth）培養(yǎng)基（1L）：

牛(niú)肉膏(gāo)（beef extract）             3g /l；

蛋(dàn)白腖 （soy peptone）              5g /l；

pH 7.0

B．喹啉降(jiàng)解(jiě)菌(jūn)分(fēn)離用培養基     單位    g/L

Na2HPO4                             1.6

KH2PO4                              1.0

NH4Cl                               0.5

K2SO4                                  0.06

CaCl2·2 H2O                         0.025

MgCl2·6 H2O                         0.1

NaHCO3                                 0.42

EDTA·Na2                            0.015

FeSO4·7H2O                          0.0015

D-BIOTIN                             0.010

KNO3                                     0.505

配製時(shí)每一(yī)成分(fēn)逐一溶化
，否(fǒu)則會產(chǎn)生沉澱。

以(yǐ)喹啉作(zuò)為*碳源時
，喹(kuí)啉的加(jiā)入(rù)量為0.5～2 mmol/L（或40ul/L～150ul/L）。對(duì)於固體(tǐ)培養(yǎng)基(jī)
，喹(kuí)啉(lán)的加入量為每塊(kuài)平板2ul～10ul喹啉(lán)（置於培養(yǎng)基表(biǎo)麵）。

*喹啉(lán)要在培養基滅菌後加(jiā)入

製(zhì)備固體分(fēn)離培(péi)養基(jī)時(shí)需加(jiā)入(rù)1.5g agar/100ml培養基(jī)。

C．反硝(xiāo)化富(fù)集培養基   單位  g/L

Na2HPO4                              1.6

KH2PO4                               1.0

NH4Cl                                0.5

K2SO4                                   0.06

CaCl2·2 H2O                          0.025

MgCl2·6 H2O                          0.1

NaHCO3                                     0.42

EDTA·Na2                             0.015

FeSO4·7H2O                           0.0015

D-BIOTIN                              0.010

KNO3                                        0.505

乙酸鈉                                 1

酒石(shí)酸(suān)鈉(nà)鉀                             2

   * 喹啉（苯酚）                           40ul（300mg） 

配(pèi)製(zhì)時每一成分逐(zhú)一(yī)溶(róng)化(huà)
，否(fǒu)則(zé)會產(chǎn)生(shēng)沉(chén)澱(diàn)。 

*喹(kuí)啉（苯酚）要(yào)在培(péi)養基滅菌後加入(rù)

製備固體(tǐ)分離培養(yǎng)基(jī)時需加入(rù)1.5g agar/100ml培養(yǎng)基(jī)。

D. 1/10TSA（Tryptic soy agar）培(péi)養基(jī)（各成分取(qǔ)/10）：

胰蛋白腖(dòng)                   15 g/l,

大豆(dòu)腖 （Soytone）          5 g/l,

NaCl                       5 g/l,

瓊脂(zhī)                       15 g/l

E．苯酚(fēn)降解菌(jūn)分離用培(péi)養(yǎng)基(jī)     單位    g/L

Na2HPO4                               1.6

KH2PO4                               1.0

NH4Cl                                0.5

K2SO4                                   0.06

CaCl2·2 H2O                         0.025

MgCl2·6 H2O                         0.1

NaHCO3                                 0.42

EDTA·Na2                            0.015

FeSO4·7H2O                          0.0015

D-BIOTIN                             0.010

KNO3                                     0.505

配製(zhì)時每一(yī)成分逐一溶化(huà)
，否(fǒu)則(zé)會(huì)產(chǎn)生沉澱(diàn)。

以苯酚(fēn)作(zuò)為(wéi)*碳(tàn)源(yuán)時
，苯酚的加入量(liáng)為(wéi)200～800 mg/L。

苯酚(fēn)要在(zài)培養基滅菌後加(jiā)入

製備固體(tǐ)分(fēn)離(lí)培(péi)養基時需加入1.5g agar/100ml培養基(jī)。

F．R2A培養(yǎng)基

酵母(mǔ)提取(qǔ)物                 0.50 g /l

胰蛋白(bái)腖(dòng)                   0.25 g /l

大豆腖(dòng) （Soytone）         0.25 g/l,

酸水(shuǐ)解酪素                 0.50 g /l

葡萄(táo)糖                     0.50 g/l

可溶澱粉                   0.50 g /l

丙酮酸鈉(nà)                   0.30 g/l

K2H PO4                       0.30 g/l

 MgSO4·7H2O               0.05 g/l

瓊脂                       15.00 g /l

在加(jiā)入瓊(qióng)脂前(qián)用結(jié)晶的磷酸(suān)氫鉀(jiǎ)或(huò)磷(lín)酸二氫鉀調整zui終(zhōng)PH值為7.2。加入瓊脂後
，加(jiā)熱(rè)培(péi)養(yǎng)基(jī)使其沸(fèi)騰(téng)
，瓊(qióng)脂溶(róng)解(jiě)後(hòu)在(zài)121℃高(gāo)壓滅菌15分鐘(zhōng)。

 LB液體培(péi)養基(jī)配方(fāng)

       蛋白腖(dòng)    10g

       酵母(mǔ)粉     5g

       NaCl       10g

       H2O          1000ml

       pH7.2