試驗原理(lǐ)：
TFPI-2試劑(jì)盒(hé)是固相夾心法酶聯免疫(yì)吸附實(shí)驗（ELISA）.已(yǐ)知(zhī)TFPI-2濃度(dù)的標準品(pǐn)，未知濃度的樣(yàng)品(pǐn)加(jiā)入(rù)微(wēi)孔酶(méi)標(biāo)板內(nèi)進行檢(jiǎn)測。先將TFPI-2和(hé)生(shēng)物(wù)素(sù)標(biāo)記(jì)的(dí)抗體(tǐ)同時溫(wēn)育。洗(xǐ)滌後(hòu)
，加入親和素標(biāo)記過的(dí)HRP。再經過(guò)溫育和(hé)洗滌(dí)
，去除未(wèi)結(jié)合(hé)的(dí)酶結合(hé)物
，然後加(jiā)入底物(wù)A，B
，和酶結(jié)合(hé)物(wù)同時作用。產(chǎn)生顏(yán)色(sè)。顏色的深(shēn)淺和樣品中(zhōng)TFPI-2的(dí)濃度呈(chéng)比例關係(xì)。

試(shì)劑盒內(nèi)容(róng)及(jí)其配製(zhì)
試(shì)劑盒成份（2-8℃保存(cún)） 96孔(kǒng)配置(zhì) 48孔(kǒng)配(pèi)置 配製(zhì)
96/48人(rén)份酶(méi)標板 1塊板（96T） 半塊板（48T） 即用(yòng)型(xíng)
塑(sù)料膜板(bǎn)蓋(gài) 1塊 半塊(kuài) 即用型(xíng)
標準(zhǔn)品：400pmol/L 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按說(shuō)明書進行稀稀
空白對(duì)照 1瓶(píng)（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用型
標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)稀釋(shì)緩衝(chōng)液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型
生物(wù)素(sù)標(biāo)記的(dí)抗(kàng)TFPI-2抗體(tǐ) 1瓶(píng)（6ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用(yòng)型
親(qīn)和鏈酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml） 即用型(xíng)
洗滌緩(huǎn)衝液 1瓶（20ml） 1瓶(píng)（10ml） 按說(shuō)明(míng)書進(jìn)行稀釋(shì)
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型
底(dǐ)物(wù)B 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型
終止液 1瓶（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用型

自備材料(liào)
1． 蒸餾水(shuǐ)。
2． 加(jiā)樣器(qì)：5ul，10ul，50ul，100ul，200ul，500ul，1000ul。
3． 振(zhèn)蕩(dàng)器(qì)及(jí)磁(cí)力攪(jiǎo)拌(bàn)器等。

安全性
1． 避免直接(jiē)接(jiē)觸(chù)終(zhōng)止(zhǐ)液和(hé)底(dǐ)物(wù)A，B。一旦接觸到這(zhè)些液體
，請盡(jìn)快(kuài)用水衝洗(xǐ)。
2． 實驗中不要(yào)吃喝，抽煙或使(shǐ)用(yòng)化(huà)妝品。
3． 不要用嘴吸取(qǔ)試劑(jì)盒裏(lǐ)的任(rèn)何(hé)成份。

操(cāo)作(zuò)注意事(shì)項
1． 試劑(jì)應按標簽說明書(shū)儲存
，使用(yòng)前恢復(fù)到室(shì)溫(wēn)。稀稀過後的(dí)標準品應(yīng)丟棄(qì)
，不(bù)可保(bǎo)存。
2． 實(shí)驗(yàn)中不(bù)用(yòng)的(dí)板條應(yīng)立即放回(huí)包(bāo)裝袋(dài)中
，密(mì)封(fēng)保(bǎo)存(cún)
，以免(miǎn)變質。
3． 不用(yòng)的(dí)其它試(shì)劑應包(bāo)裝好(hǎo)或(huò)蓋好(hǎo)。不同批號(hào)的(dí)試(shì)劑(jì)不(bù)要混用。保質(zhì)前(qián)使用(yòng)。
4． 使(shǐ)用一(yī)次性的吸頭以免交(jiāo)叉(chā)汙(wū)染(rǎn)
，吸(xī)取終(zhōng)止液和底(dǐ)物(wù)A，B液時
，避免使(shǐ)用帶金屬部(bù)分的(dí)加樣器。
5． 使用幹(gān)淨的(dí)塑料容(róng)器配(pèi)置洗(xǐ)滌(dí)液。使用(yòng)前充分(fēn)混(hùn)匀試劑盒(hé)裏(lǐ)的(dí)各(gè)種成(chéng)份及樣(yàng)品。
6． 洗(xǐ)滌(dí)酶(méi)標板時應充(chōng)分(fēn)拍(pāi)幹(gān)
，不要將(jiāng)吸水紙(zhǐ)直接放入(rù)酶標反(fǎn)應孔中(zhōng)吸水。
7． 底物(wù)A應揮發(fā)
，避免(miǎn)長時(shí)間打開(kāi)蓋子。底(dǐ)物B對光敏感(gǎn)
，避免(miǎn)長(cháng)時(shí)間(jiān)暴(bào)露於(yú)光下(xià)。避(bì)免用(yòng)手接(jiē)觸(chù)
，有毒。實(shí)驗完(wán)成(chéng)後(hòu)應(yīng)立即讀取OD值。
8． 加入試(shì)劑的(dí)順序(xù)應(yīng)一致(zhì)
，以保(bǎo)證所有(yǒu)反(fǎn)應板孔(kǒng)溫育的(dí)時(shí)間(jiān)一樣(yàng)。
9． 按(àn)照說明書(shū)中(zhōng)標明(míng)的(dí)時(shí)間，加(jiā)液(yè)的量及順(shùn)序(xù)進行(háng)溫(wēn)育操作。

樣品(pǐn)收(shōu)集(jí)，處(chǔ)理(lǐ)及(jí)保存(cún)方(fāng)法
1， 血清-----操(cāo)作過程(chéng)中避(bì)免任何細(xì)胞(bāo)刺(cì)激。使(shǐ)用不含(hán)熱(rè)原和(hé)內毒(dú)素的(dí)試管。收集(jí)血液後
，1000×g離心10分鐘將血清(qīng)和紅(hóng)細(xì)胞(bāo)迅速(sù)小心地分離。
2， 血(xiě)漿-----EDTA，檸(níng)檬(méng)酸鹽，肝素(sù)血漿可(kě)用於(yú)檢測(cè)。1000×g離(lí)心(xīn)30分鐘(zhōng)去(qù)除顆(kē)粒(lì)。
3， 細(xì)胞上(shàng)清(qīng)液(yè)---1000×g離心10分鐘(zhōng)去(qù)除顆粒(lì)和聚合物(wù)。
4， 保存------如果(guǒ)樣(yàng)品不(bù)立即使(shǐ)用
，應將其(qí)分(fēn)成小(xiǎo)部分(fēn)-70 ℃保(bǎo)存
，避免(miǎn)反復冷(lěng)凍(dòng)。盡(jìn)可能(néng)的(dí)不要使(shǐ)用(yòng)溶血或(huò)高血脂(zhī)血(xiě)。如(rú)果(guǒ)血清(qīng)中大量顆粒
，檢測前先(xiān)離(lí)心(xīn)或過(guò)濾(lǜ)。不(bù)要在37℃或更高的溫度加(jiā)熱(rè)解凍。應(yīng)在(zài)室(shì)溫下解凍並確(què)保(bǎo)樣品均匀(yún)地(dì)充分(fēn)解凍。

試劑(jì)的準備
1． 標準品：標準(zhǔn)品的係列(liè)稀釋應在實(shí)驗時(shí)準備
，不能(néng)儲存。稀釋(shì)前將(jiāng)標(biāo)準(zhǔn)品振(zhèn)蕩混匀。稀釋比(bǐ)例按下表中(zhōng)進行(háng)：
400 pmol/L （6號標準(zhǔn)品(pǐn)） 原(yuán)倍濃(nóng)度(dù)不(bù)用稀(xī)釋直接(jiē)加入50ul。
200 pmol/L （5號標準品(pǐn)） 100ul的(dí)原倍(bèi)標準品加(jiā)入100ul的標準(zhǔn)品(pǐn)稀(xī)釋(shì)液(yè)
100 pmol/L （4號標準品） 100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標準品(pǐn)稀釋(shì)液
50 pmol/L （3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的(dí)4號(hào)標準品加(jiā)入(rù)100ul的標(biāo)準品稀(xī)釋液
25 pmol/L （2號標準品） 100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入(rù)100ul的標準品稀(xī)釋(shì)液(yè)
12.5 pmol/L （1號標(biāo)準品） 100ul的(dí)2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標準品稀釋液(yè)
0 pmol/L （空(kōng)白對(duì)照） 原始(shǐ)濃度(dù)不用(yòng)稀釋直接(jiē)加(jiā)入(rù)50ul。

2． 洗滌(dí)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀(xī)釋(shì)。

操(cāo)作步(bù)驟(zhòu)
1． 使用(yòng)前
，將所有試劑充(chōng)分混(hùn)匀。不(bù)要使(shǐ)液體(tǐ)產(chǎn)生(shēng)大(dà)量(liáng)的(dí)泡(pào)沫(mò)
，以(yǐ)免加(jiā)樣(yàng)時加(jiā)入大量(liáng)的(dí)氣泡
，產(chǎn)生加(jiā)樣(yàng)上的誤差(chà)。
2． 根(gēn)據待(dài)測樣(yàng)品數量(liáng)加(jiā)上(shàng)標準品(pǐn)的(dí)數量決定所需(xū)的(dí)板條數。每個(gè)標(biāo)準品(pǐn)和(hé)空白孔(kǒng)建(jiàn)議做復孔。每(měi)個(gè)樣(yàng)品根據(jù)自(zì)己(jǐ)的數量來(lái)定(dìng)
，能(néng)使用(yòng)復孔的(dí)盡量做復孔(kǒng)。
3． 加入稀釋(shì)好後的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)50ul於反應孔，加(jiā)入(rù)待(dài)測樣品50ul於反應孔(kǒng)內(nèi)。立(lì)即加(jiā)入50ul的生物素(sù)標記的(dí)抗體。蓋(gài)上膜板
，輕(qīng)輕振蕩混(hùn)匀
，37℃溫育1小時。
4． 甩(shuǎi)去(qù)孔(kǒng)內液(yè)體
，每(měi)孔加(jiā)滿(mǎn)洗滌液(yè)
，振(zhèn)蕩(dàng)30秒
，甩(shuǎi)去(qù)洗滌液(yè)
，用(yòng)吸(xī)水紙(zhǐ)拍幹。重復(fù)此操作3次(cì)。如(rú)果用(yòng)洗板機洗滌
，洗(xǐ)滌次數(shù)增(zēng)加(jiā)一(yī)次(cì)。
5． 每(měi)孔加入(rù)80ul的(dí)親和鏈酶素-HRP
，輕(qīng)輕振(zhèn)蕩(dàng)混(hùn)匀
，37℃溫(wēn)育30分鐘(zhōng)。
6． 甩(shuǎi)去孔(kǒng)內液(yè)體(tǐ)
，每孔(kǒng)加(jiā)滿洗滌(dí)液
，振蕩30秒
，甩去(qù)洗滌液
，用吸水紙拍幹。重復此操作(zuò)3次。如果用(yòng)洗板(bǎn)機洗滌
，洗(xǐ)滌次數(shù)增加(jiā)一(yī)次(cì)。
7． 每(měi)孔加入(rù)底物A，B各(gè)50ul
，輕輕振蕩混(hùn)匀
，37℃溫育10分(fēn)鐘(zhōng)。避免光(guāng)照(zhào)。
8． 取(qǔ)出酶(méi)標(biāo)板(bǎn)
，迅速(sù)加入50ul終止液(yè)
，加入(rù)終止(zhǐ)液(yè)後應立即(jí)測(cè)定結(jié)果。
9． 在(zài)450nm波(bō)長處(chǔ)測(cè)定各(gè)孔的(dí)OD值。

建議(yì)使用(yòng)的實(shí)驗(yàn)方案
 標準(zhǔn)品濃(nóng)度(dù)（pmol/L） 
A 400 400 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品
B 200 200 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品
C 100 100 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品
D 50 50 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品
E 25 25 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品
F 12.5 12.5 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品
G 0 0 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品
H 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn)

局(jú)限(xiàn)
6號標準(zhǔn)品以(yǐ)上(shàng)的(dí)結(jié)果為非(fēi)綫(xiàn)性的(dí)
，根(gēn)據此(cǐ)標準曲(qū)綫無法得到的結(jié)果。

試劑盒(hé)性(xìng)能
1. 靈敏(mǐn)度(dù)：zui小的檢(jiǎn)測濃(nóng)度(dù)小(xiǎo)於1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀(xī)釋度(dù)的(dí)綫(xiàn)性(xìng)。樣(yàng)品(pǐn)綫性(xìng)回歸(guī)與預(yù)期濃度相(xiāng)關(guān)係(xì)數(shù)R值(zhí)為0.990。
2. 特異性：不(bù)與其它(tā)細(xì)胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性(xìng)：板(bǎn)內，板間(jiān)變(biàn)異(yì)係數均小於10%。

結(jié) 果 判 斷 與(yǔ) 分(fēn) 析
1，儀器值(zhí)：於波(bō)長(cháng)450nm的酶(méi)標儀上讀(dú)取各孔的OD值(zhí)

2，以(yǐ)吸(xī)光度OD值為(wéi)縱(zòng)坐(zuò)標(biāo)（Y）
，相應的TFPI-2標(biāo)準品濃(nóng)度(dù)為橫坐標（X）
，做得(dé)相應(yīng)的曲綫
，樣(yàng)品的(dí)TFPI-2含量(liáng)可(kě)根據其OD值(zhí)由(yóu)標準曲綫換算(suàn)出(chū)相應(yīng)的濃度。

3，檢(jiǎn)測(cè)值(zhí)範(fàn)圍：0-400pmol/L

4，敏感(gǎn)度： 1.0 pmol/L