本(běn)試劑僅供研究使(shǐ)用 標本：血清或(huò)血漿(jiāng)

試(shì)驗原理：
ET-1試劑盒是(shì)固(gù)相夾心(xīn)法酶聯(lián)免疫(yì)吸附實驗(yàn)（ELISA）.已知(zhī)ET-1濃度(dù)的(dí)標準(zhǔn)品(pǐn)，未(wèi)知(zhī)濃度的樣品加入微孔(kǒng)酶標板內進(jìn)行檢測。先將ET-1和生物素(sù)標記的抗(kàng)體同(tóng)時溫(wēn)育。洗滌後(hòu)，加入(rù)親(qīn)和(hé)素標(biāo)記過的(dí)HRP。再經(jīng)過溫育和(hé)洗(xǐ)滌，去(qù)除(chú)未結(jié)合的(dí)酶結(jié)合物(wù)，然後加(jiā)入底物(wù)A，B，和(hé)酶(méi)結合物(wù)同(tóng)時作用(yòng)。產(chǎn)生顏(yán)色(sè)。顏(yán)色的(dí)深淺(qiǎn)和(hé)樣品中(zhōng)ET-1的濃度(dù)呈比(bǐ)例(lì)關係(xì)。

試劑盒內(nèi)容(róng)及其(qí)配製
試劑盒成份（2-8℃保存(cún)） 96孔(kǒng)配置(zhì) 48孔(kǒng)配(pèi)置(zhì) 配製
96/48人份酶標(biāo)板(bǎn) 1塊板（96T） 半塊(kuài)板（48T） 即用型(xíng)
塑料膜(mó)板(bǎn)蓋 1塊 半塊(kuài) 即(jí)用(yòng)型
標準(zhǔn)品：80pg/ml 1瓶(píng)（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按說明(míng)書進行(háng)稀稀
空(kōng)白(bái)對照(zhào) 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用型(xíng)
標準(zhǔn)品(pǐn)稀釋緩衝液(yè) 1瓶(píng)（5ml） 1瓶（2.5ml） 即(jí)用型(xíng)
生(shēng)物素(sù)標(biāo)記的抗ET-1抗(kàng)體(tǐ) 1瓶(píng)（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用型(xíng)
親(qīn)和(hé)鏈(liàn)酶(méi)素-HRP 1瓶(píng)（10ml） 1瓶(píng)（5.0ml） 即用型(xíng)
洗(xǐ)滌(dí)緩(huǎn)衝(chōng)液 1瓶（20ml） 1瓶(píng)（10ml） 按說明(míng)書進(jìn)行稀釋(shì)
底物A 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型(xíng)
底物(wù)B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型
終止液 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用型

自(zì)備(bèi)材(cái)料
1． 蒸(zhēng)餾(liù)水。
2． 加樣器：5ul，10ul，50ul，100ul，200，500ul，1000ul。
3． 振蕩器及磁(cí)力攪拌器等(děng)。

安(ān)全性
1． 避免(miǎn)直接(jiē)接(jiē)觸終(zhōng)止(zhǐ)液和底物A，B。一旦接(jiē)觸到這些液體，請(qǐng)盡快(kuài)用水衝洗。
2． 實(shí)驗中不(bù)要(yào)吃(chī)喝(hē)，抽(chōu)煙或使用化(huà)妝(zhuāng)品。
3． 不要(yào)用(yòng)嘴(zuǐ)吸(xī)取試劑(jì)盒裏(lǐ)的任何成(chéng)份(fèn)。

操作注意事(shì)項
1． 試劑應(yīng)按(àn)標(biāo)簽(qiān)說(shuō)明書儲(chǔ)存，使(shǐ)用前(qián)恢復(fù)到室(shì)溫。稀稀過後的標準(zhǔn)品應(yīng)丟(diū)棄，不可保存(cún)。
2． 實驗中不(bù)用的板(bǎn)條(tiáo)應(yīng)立即放回(huí)包裝袋中(zhōng)，密封保(bǎo)存，以免變(biàn)質。
3． 不用的其它(tā)試(shì)劑(jì)應包(bāo)裝好(hǎo)或(huò)蓋好。不(bù)同(tóng)批(pī)號的試(shì)劑(jì)不要(yào)混(hùn)用。保質前(qián)使用。
4． 使(shǐ)用(yòng)一次(cì)性的吸頭(tóu)以(yǐ)免(miǎn)交叉(chā)汙染，吸取(qǔ)終止(zhǐ)液和底物(wù)A，B液(yè)時，避免(miǎn)使用(yòng)帶金(jīn)屬部分的加(jiā)樣器。
5． 使(shǐ)用幹淨的(dí)塑(sù)料容(róng)器(qì)配(pèi)置洗滌液(yè)。使用前充(chōng)分混匀試劑盒裏的各種成份(fèn)及(jí)樣品(pǐn)。
6． 洗滌(dí)酶(méi)標板(bǎn)時應充(chōng)分(fēn)拍幹(gān)，不要將吸(xī)水紙直接(jiē)放入酶標(biāo)反(fǎn)應孔中(zhōng)吸水(shuǐ)。
7． 底物(wù)A應揮發(fā)，避免長(cháng)時間打開蓋子(zǐ)。底物B對(duì)光敏感(gǎn)，避(bì)免長時(shí)間(jiān)暴露於光下(xià)。避免用(yòng)手(shǒu)接觸(chù)，有(yǒu)毒。實驗(yàn)完成(chéng)後應立即讀取OD值(zhí)。
8． 加(jiā)入試劑(jì)的順序應一(yī)致，以保證(zhèng)所有反應板孔(kǒng)溫育(yù)的時間一樣。
9． 按照說(shuō)明書中標明的時間(jiān)，加(jiā)液(yè)的量及順序(xù)進行溫(wēn)育操作(zuò)。

樣品(pǐn)收(shōu)集(jí)，處(chǔ)理及(jí)保存方法
1， 血清(qīng)-----操作過程中避(bì)免任何細胞刺(cì)激。使用不(bù)含(hán)熱(rè)原(yuán)和(hé)內毒素的試(shì)管(guǎn)。收集(jí)血液(yè)後，1000×g離心(xīn)10分(fēn)鐘(zhōng)將血(xiě)清和紅細胞(bāo)迅速小(xiǎo)心地分(fēn)離。
2， 血(xiě)漿(jiāng)-----EDTA，檸檬酸鹽，肝(gān)素血(xiě)漿(jiāng)可用於檢(jiǎn)測(cè)。1000×g離(lí)心(xīn)30分鐘去(qù)除顆粒。
3， 細(xì)胞上清(qīng)液(yè)---1000×g離心10分(fēn)鐘(zhōng)去除(chú)顆(kē)粒(lì)和聚(jù)合物。
4， 保(bǎo)存------如果(guǒ)樣品不(bù)立(lì)即(jí)使(shǐ)用，應將其分(fēn)成小部分-70 ℃保(bǎo)存(cún)，避(bì)免(miǎn)反復(fù)冷凍。盡可(kě)能(néng)的不要(yào)使用溶(róng)血或高血(xiě)脂血。如(rú)果血(xiě)清中大(dà)量顆(kē)粒(lì)，檢測(cè)前先離(lí)心或過濾。不要在37℃或(huò)更高的(dí)溫度加(jiā)熱解凍(dòng)。應在室溫(wēn)下解(jiě)凍並(bìng)確保樣(yàng)品(pǐn)均(jūn)匀地充分解(jiě)凍。

試(shì)劑的準備
1． 標準品：標準(zhǔn)品的(dí)係列稀釋應在實(shí)驗時(shí)準(zhǔn)備(bèi)，不能儲(chǔ)存(cún)。稀(xī)釋(shì)前將標(biāo)準品(pǐn)振蕩混(hùn)匀。稀(xī)釋比(bǐ)例(lì)按下表中進行：
80 pg/ml （6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 原(yuán)倍濃(nóng)度不用稀(xī)釋(shì)直接(jiē)加(jiā)入(rù)50ul。
40 pg/ml （5號(hào)標準(zhǔn)品） 100ul的(dí)原(yuán)倍(bèi)標準品加入(rù)100ul的(dí)標準(zhǔn)品稀釋液(yè)
20 pg/ml （4號標準(zhǔn)品） 100ul的(dí)5號標準品(pǐn)加(jiā)入(rù)100ul的(dí)標準品稀釋(shì)液
10 pg/ml （3號標準品(pǐn)） 100ul的(dí)4號標準品加(jiā)入(rù)100ul的(dí)標準(zhǔn)品稀(xī)釋液
5.0 pg/ml （2號標準(zhǔn)品） 100ul的3號標準品加入100ul的標(biāo)準品稀釋(shì)液
2.5 pg/ml （1號標準品） 100ul的2號標準(zhǔn)品加(jiā)入(rù)100ul的標準品(pǐn)稀釋(shì)液(yè)
0 pg/ml （空(kōng)白(bái)對(duì)照） 原始濃度(dù)不用稀(xī)釋(shì)直(zhí)接加入50ul。

2． 洗(xǐ)滌緩衝(chōng)液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步(bù)驟(zhòu)
1． 使用(yòng)前(qián)，將所有試(shì)劑充(chōng)分(fēn)混(hùn)匀。不(bù)要使液(yè)體產生大(dà)量的泡沫，以免(miǎn)加樣(yàng)時加(jiā)入大(dà)量的(dí)氣泡，產生(shēng)加樣上(shàng)的(dí)誤(wù)差(chà)。
2． 根(gēn)據待(dài)測(cè)樣品數量加上(shàng)標準(zhǔn)品的數(shù)量決定(dìng)所(suǒ)需(xū)的(dí)板條(tiáo)數。每(měi)個(gè)標準品和(hé)空白孔建議做復(fù)孔(kǒng)。每個(gè)樣品根據自己的(dí)數(shù)量來(lái)定(dìng)，能使用(yòng)復孔(kǒng)的盡(jìn)量(liáng)做復孔。
3． 加入稀釋好(hǎo)後的(dí)標(biāo)準品50ul於反應(yīng)孔，加入待測樣品(pǐn)50ul於(yú)反應孔內。立(lì)即加入50ul的生(shēng)物素(sù)標記(jì)的抗體。蓋(gài)上膜(mó)板(bǎn)，輕(qīng)輕(qīng)振蕩(dàng)混(hùn)匀(yún)，37℃溫育(yù)1小(xiǎo)時。
4． 甩去孔(kǒng)內(nèi)液(yè)體，每(měi)孔(kǒng)加滿(mǎn)洗(xǐ)滌(dí)液，振蕩(dàng)30秒(miǎo)，甩去洗滌(dí)液，用吸(xī)水(shuǐ)紙拍(pāi)幹。重(zhòng)復此(cǐ)操作(zuò)3次。如(rú)果用洗(xǐ)板機(jī)洗(xǐ)滌(dí)，洗(xǐ)滌(dí)次(cì)數(shù)增加一次。
5． 每孔加入(rù)80ul的親和鏈酶(méi)素-HRP，輕(qīng)輕(qīng)振蕩(dàng)混匀，37℃溫(wēn)育(yù)30分鐘(zhōng)。
6． 甩去孔(kǒng)內液(yè)體，每(měi)孔加滿洗滌液(yè)，振(zhèn)蕩30秒，甩(shuǎi)去洗(xǐ)滌(dí)液，用吸(xī)水紙拍幹(gān)。重復此操作3次。如果(guǒ)用(yòng)洗板機(jī)洗(xǐ)滌，洗(xǐ)滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加(jiā)入底(dǐ)物(wù)A，B各50ul，輕輕(qīng)振蕩混(hùn)匀，37℃溫育(yù)10分鐘。避免(miǎn)光(guāng)照。
8． 取出酶(méi)標(biāo)板，迅速(sù)加(jiā)入50ul終止(zhǐ)液(yè)，加入(rù)終止(zhǐ)液後(hòu)應立(lì)即測(cè)定(dìng)結果。
9． 在450nm波(bō)長(cháng)處測定(dìng)各(gè)孔的(dí)OD值。

建議(yì)使(shǐ)用(yòng)的(dí)實驗(yàn)方(fāng)案
 標準(zhǔn)品濃(nóng)度(dù)（pg/ml） 
A 80 80 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣品
B 40 40 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn)
C 20 20 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品
D 10 10 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn)
E 5.0 5.0 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品
F 2.5 2.5 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品(pǐn)
G 0 0 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品
H 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品(pǐn)

局(jú)限
6號標(biāo)準品(pǐn)以上的結果(guǒ)為非綫性的，根據此標準曲綫無法得(dé)到的(dí)結(jié)果(guǒ)。

試劑盒性(xìng)能(néng)
1. 靈敏度：zui小(xiǎo)的(dí)檢測濃(nóng)度小(xiǎo)於1號(hào)標準品(pǐn)。稀釋(shì)度(dù)的(dí)綫性。樣品(pǐn)綫(xiàn)性回歸(guī)與預期(qī)濃度(dù)相(xiāng)關(guān)係數(shù)R值(zhí)為0.990。
2. 特異(yì)性：不與人(rén)其它細胞(bāo)因(yīn)子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內，板間變異(yì)係(xì)數均小於(yú)10%。

結 果 判(pàn) 斷 與 分(fēn) 析
1，儀器值(zhí)：於波長450nm的酶標儀上(shàng)讀取各(gè)孔(kǒng)的OD值(zhí)

2，以吸(xī)光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應的ET-1標準品(pǐn)濃度為(wéi)橫坐標(biāo)（X），做(zuò)得(dé)相應的曲(qū)綫，樣(yàng)品的(dí)ET-1含量(liáng)可(kě)根據其OD值(zhí)由標(biāo)準曲(qū)綫換算出(chū)相應(yīng)的濃度。

3，檢測(cè)值範圍：0-80pg/ml

4，敏感度： 0.1 pg/ml