大(dà)鼠 （Rat） 環磷酸鳥苷（cGMP）ELISA 檢測試(shì)劑盒
本(běn)試劑僅(jǐn)供(gōng)研(yán)究使(shǐ)用 標本：血清或血(xiě)漿(jiāng)

試(shì)驗原理(lǐ)：
cGMP試(shì)劑(jì)盒是(shì)固相夾心法酶聯免(miǎn)疫吸附(fù)實驗（ELISA）.已(yǐ)知cGMP濃(nóng)度的標(biāo)準(zhǔn)品，未知(zhī)濃度(dù)的樣(yàng)品加入微孔酶(méi)標板內(nèi)進行檢(jiǎn)測。先(xiān)將(jiāng)cGMP和生物(wù)素標(biāo)記(jì)的抗體(tǐ)同(tóng)時(shí)溫育(yù)。洗(xǐ)滌後，加(jiā)入親(qīn)和素標記(jì)過的(dí)HRP。再經(jīng)過溫(wēn)育和洗(xǐ)滌(dí)，去除未結合的酶(méi)結合(hé)物，然後加入底(dǐ)物A，B，和酶結(jié)合(hé)物(wù)同時作用(yòng)。產生顏色。顏色的深淺和(hé)樣(yàng)品(pǐn)中cGMP的濃度呈(chéng)比例(lì)關係。

試(shì)劑(jì)盒(hé)內(nèi)容(róng)及(jí)其配(pèi)製(zhì)
試(shì)劑盒成(chéng)份(fèn)（2-8℃保存(cún)） 96孔配置 48孔(kǒng)配(pèi)置 配製(zhì)
96/48人份酶標板 1塊板(bǎn)（96T） 半塊(kuài)板（48T） 即(jí)用型
塑料膜板蓋 1塊 半塊 即(jí)用型
標準品(pǐn)：800pmol/L 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按(àn)說明書(shū)進行稀稀
空(kōng)白(bái)對(duì)照 1瓶（1.0ml） 1瓶(píng)（0.5ml） 即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩衝(chōng)液 1瓶（5ml） 1瓶(píng)（2.5ml） 即用(yòng)型(xíng)
生物(wù)素標記(jì)的(dí)抗(kàng)cGMP抗體 1瓶（6ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即(jí)用型(xíng)
親和鏈酶(méi)素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml） 即(jí)用型
洗滌緩衝液 1瓶（20ml） 1瓶(píng)（10ml） 按說(shuō)明書進行稀釋(shì)
底(dǐ)物A 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用(yòng)型
底(dǐ)物(wù)B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用型
終止液(yè) 1瓶（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型(xíng)

自(zì)備(bèi)材料(liào)
1． 蒸餾水(shuǐ)。
2． 加樣器：5ul，10ul，50ul，100ul，200，500ul，1000ul。
3． 振蕩(dàng)器(qì)及磁(cí)力(lì)攪(jiǎo)拌(bàn)器等(děng)。

安(ān)全(quán)性
1． 避免直接接觸終止液和底物A，B。一旦接(jiē)觸(chù)到這些液(yè)體(tǐ)，請盡快(kuài)用水衝(chōng)洗(xǐ)。
2． 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝(hē)，抽(chōu)煙或(huò)使用化妝品。
3． 不要用(yòng)嘴吸取(qǔ)試劑(jì)盒(hé)裏的(dí)任(rèn)何成份(fèn)。

操(cāo)作(zuò)注意事(shì)項(xiàng)
1． 試(shì)劑(jì)應按(àn)標(biāo)簽說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存，使用(yòng)前恢(huī)復到(dào)室溫。稀稀過後(hòu)的標準品應丟棄，不可保存。
2． 實驗中不用的板(bǎn)條(tiáo)應立即放回包裝袋中(zhōng)，密封保存，以(yǐ)免變質。
3． 不用的(dí)其它(tā)試劑應(yīng)包裝好或(huò)蓋好。不(bù)同批號的試(shì)劑不要混用(yòng)。保質(zhì)前使用。
4． 使用(yòng)一次性的(dí)吸頭(tóu)以(yǐ)免交叉汙(wū)染(rǎn)，吸(xī)取終(zhōng)止液和(hé)底物(wù)A，B液時，避(bì)免(miǎn)使用帶金屬部(bù)分的(dí)加樣器(qì)。
5． 使(shǐ)用幹淨(jìng)的(dí)塑料容(róng)器配置洗滌液(yè)。使用(yòng)前(qián)充分(fēn)混匀試劑盒裏(lǐ)的各種(zhǒng)成(chéng)份及樣品。
6． 洗(xǐ)滌酶(méi)標(biāo)板(bǎn)時(shí)應充分(fēn)拍幹，不要將吸(xī)水紙直(zhí)接(jiē)放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸(xī)水(shuǐ)。
7． 底物A應(yīng)揮發，避(bì)免長時間(jiān)打開(kāi)蓋子。底(dǐ)物B對光敏感，避(bì)免(miǎn)長時(shí)間暴露於光下。避(bì)免用手(shǒu)接觸，有毒。實驗完成後應(yīng)立即讀(dú)取OD值。
8． 加(jiā)入試(shì)劑的順序應(yīng)一致，以(yǐ)保證所(suǒ)有反應板(bǎn)孔(kǒng)溫育的(dí)時間一(yī)樣。
9． 按(àn)照說(shuō)明書中標(biāo)明的(dí)時間，加(jiā)液(yè)的(dí)量及順序進行溫(wēn)育(yù)操作。

樣(yàng)品(pǐn)收集(jí)，處(chǔ)理及保(bǎo)存(cún)方法
1， 血清(qīng)-----操(cāo)作(zuò)過程中(zhōng)避(bì)免任何細胞刺(cì)激。使用不含熱(rè)原和內毒素的試(shì)管(guǎn)。收(shōu)集血(xiě)液(yè)後(hòu)，1000×g離(lí)心(xīn)10分鐘將血清(qīng)和紅細胞(bāo)迅速小心地(dì)分離(lí)。
2， 血漿(jiāng)-----EDTA，檸(níng)檬(méng)酸(suān)鹽(yán)，肝(gān)素(sù)血漿(jiāng)可用於(yú)檢測。1000×g離心30分鐘去除顆(kē)粒(lì)。
3， 細(xì)胞上清(qīng)液(yè)---1000×g離心10分(fēn)鐘去除顆(kē)粒(lì)和聚(jù)合物。
4， 保(bǎo)存------如果樣品(pǐn)不(bù)立即(jí)使(shǐ)用(yòng)，應(yīng)將(jiāng)其(qí)分(fēn)成小(xiǎo)部(bù)分-70 ℃保(bǎo)存，避免反(fǎn)復冷凍。盡(jìn)可(kě)能(néng)的(dí)不要(yào)使(shǐ)用溶(róng)血或(huò)高(gāo)血(xiě)脂血(xiě)。如果(guǒ)血清中(zhōng)大量顆粒，檢(jiǎn)測前(qián)先(xiān)離心或(huò)過濾(lǜ)。不(bù)要(yào)在37℃或更高的(dí)溫(wēn)度加(jiā)熱(rè)解凍(dòng)。應在(zài)室溫(wēn)下解(jiě)凍並確保(bǎo)樣(yàng)品均(jūn)匀(yún)地(dì)充分(fēn)解(jiě)凍。

試劑(jì)的(dí)準(zhǔn)備
1． 標準品：標準品(pǐn)的(dí)係列(liè)稀(xī)釋(shì)應在實驗時準備(bèi)，不能儲存。稀(xī)釋前(qián)將標準品(pǐn)振蕩(dàng)混匀(yún)。稀(xī)釋(shì)比例(lì)按下表中(zhōng)進行(háng)：
800 pmol/L （6號標準(zhǔn)品） 原倍濃度(dù)不(bù)用稀(xī)釋(shì)直接(jiē)加(jiā)入(rù)50ul。
400 pmol/L （5號標(biāo)準品） 100ul的原倍(bèi)標準(zhǔn)品加入(rù)100ul的標準品稀(xī)釋(shì)液
200 pmol/L （4號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的5號標(biāo)準品(pǐn)加入(rù)100ul的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)稀釋液(yè)
100 pmol/L （3號(hào)標準品） 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入(rù)100ul的標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋液
50 pmol/L （2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)） 100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)加入100ul的(dí)標準(zhǔn)品稀釋(shì)液(yè)
25 pmol/L （1號標準品） 100ul的(dí)2號標準品(pǐn)加入100ul的(dí)標準品(pǐn)稀釋液
0 pmol/L （空(kōng)白對(duì)照） 原(yuán)始(shǐ)濃度不用稀(xī)釋(shì)直接(jiē)加(jiā)入(rù)50ul。

2． 洗(xǐ)滌(dí)緩衝(chōng)液（50×）的(dí)稀釋：蒸餾(liù)水(shuǐ)50倍稀(xī)釋(shì)。

操(cāo)作步驟
1． 使用前，將所(suǒ)有試劑充分(fēn)混(hùn)匀(yún)。不要(yào)使(shǐ)液(yè)體產生大(dà)量(liáng)的(dí)泡(pào)沫，以免加(jiā)樣時(shí)加(jiā)入大量的氣泡(pào)，產生加樣上的誤(wù)差。
2． 根據待測樣(yàng)品數量(liáng)加上標準(zhǔn)品(pǐn)的數量決(jué)定(dìng)所(suǒ)需(xū)的(dí)板條數(shù)。每個標(biāo)準品(pǐn)和空(kōng)白孔(kǒng)建議做復孔(kǒng)。每(měi)個樣品(pǐn)根據自(zì)己的數量來定，能(néng)使用復孔的盡量做復孔。
3． 加(jiā)入(rù)稀釋好(hǎo)後的(dí)標(biāo)準品50ul於(yú)反應孔(kǒng)，加入待測樣品50ul於(yú)反(fǎn)應(yīng)孔內(nèi)。立即(jí)加(jiā)入50ul的生物素(sù)標記的(dí)抗(kàng)體(tǐ)。蓋上膜板(bǎn)，輕(qīng)輕(qīng)振蕩混匀(yún)，37℃溫(wēn)育1小時(shí)。
4． 甩去孔(kǒng)內液體(tǐ)，每孔加(jiā)滿(mǎn)洗滌(dí)液，振(zhèn)蕩30秒，甩去洗(xǐ)滌(dí)液，用(yòng)吸水紙拍幹(gān)。重(zhòng)復此操作(zuò)3次(cì)。如果用洗板機(jī)洗滌(dí)，洗滌次數增(zēng)加一次。
5． 每孔(kǒng)加(jiā)入(rù)80ul的親(qīn)和鏈酶素-HRP，輕(qīng)輕振蕩混匀，37℃溫(wēn)育(yù)30分(fēn)鐘(zhōng)。
6． 甩去(qù)孔(kǒng)內液(yè)體(tǐ)，每(měi)孔加(jiā)滿洗(xǐ)滌(dí)液，振(zhèn)蕩30秒，甩(shuǎi)去(qù)洗(xǐ)滌(dí)液(yè)，用吸(xī)水紙拍(pāi)幹。重(zhòng)復(fù)此操作(zuò)3次(cì)。如(rú)果(guǒ)用(yòng)洗板(bǎn)機(jī)洗滌(dí)，洗(xǐ)滌次(cì)數增(zēng)加(jiā)一次。
7． 每(měi)孔加(jiā)入底物A，B各50ul，輕(qīng)輕(qīng)振(zhèn)蕩混匀，37℃溫育10分鐘(zhōng)。避免光照。
8． 取出(chū)酶標(biāo)板，迅速(sù)加入(rù)50ul終止液，加入(rù)終止(zhǐ)液(yè)後(hòu)應(yīng)立即(jí)測定結果(guǒ)。
9． 在450nm波長(cháng)處(chǔ)測定各(gè)孔的(dí)OD值。

建(jiàn)議使用的(dí)實驗方案(àn)
 標準(zhǔn)品濃度（pmol/L） 
A 800 800 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品
B 400 400 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品
C 200 200 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品
D 100 100 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品
E 50 50 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品
F 25 25 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn)
G 0 0 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn)

局限(xiàn)
6號(hào)標準品以上的結果(guǒ)為非(fēi)綫性(xìng)的，根(gēn)據此(cǐ)標(biāo)準曲綫(xiàn)無法得(dé)到的結果(guǒ)。

試(shì)劑盒性(xìng)能
1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度(dù)小(xiǎo)於(yú)1號標準(zhǔn)品。稀釋度(dù)的(dí)綫性。樣品綫(xiàn)性(xìng)回(huí)歸與(yǔ)預(yù)期濃度相關係數R值為0.990。
2. 特(tè)異性：不(bù)與其它(tā)細(xì)胞因子(zǐ)反應。
3. 重(zhòng)復(fù)性：板內(nèi)，板間變(biàn)異係數均(jūn)小(xiǎo)於(yú)10%。

結 果 判 斷(duàn) 與 分(fēn) 析
1，儀器值：於(yú)波長(cháng)450nm的(dí)酶標(biāo)儀上讀(dú)取各孔(kǒng)的OD值

2，以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的cGMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度(dù)為(wéi)橫坐標（X），做得(dé)相(xiāng)應(yīng)的曲綫，樣(yàng)品的cGMP含(hán)量可(kě)根(gēn)據(jù)其OD值(zhí)由(yóu)標準(zhǔn)曲(qū)綫(xiàn)換算(suàn)出相(xiāng)應(yīng)的濃度。

3，檢測值(zhí)範圍(wéi)：0-800pmol/L

4，敏感(gǎn)度： 1.0 pmol/L