試(shì)驗原(yuán)理(lǐ)：
HL試劑盒是固(gù)相夾(jiā)心(xīn)法(fǎ)酶聯(lián)免(miǎn)疫吸(xī)附實驗(yàn)（ELISA）.已知HL濃度的(dí)標準(zhǔn)品
，未知(zhī)濃(nóng)度的(dí)樣品加入(rù)微孔(kǒng)酶標板(bǎn)內進行檢測(cè)。先(xiān)將(jiāng)HL和生物(wù)素標(biāo)記的(dí)抗(kàng)體同時溫(wēn)育。洗(xǐ)滌後(hòu)，加入親和(hé)素標(biāo)記(jì)過(guò)的HRP。再(zài)經(jīng)過溫育和(hé)洗滌，去(qù)除(chú)未結合的(dí)酶結合(hé)物，然後(hòu)加(jiā)入(rù)底(dǐ)物A
，B，和酶結合(hé)物同(tóng)時(shí)作(zuò)用(yòng)。產生(shēng)顏(yán)色(sè)。顏(yán)色的深淺(qiǎn)和(hé)樣品中HL的濃度呈比(bǐ)例關(guān)係。

試(shì)劑盒內容及其(qí)配(pèi)製
試劑(jì)盒(hé)成(chéng)份（2-8℃保(bǎo)存） 96孔配(pèi)置 48孔配(pèi)置 配製
96/48人(rén)份(fèn)酶(méi)標板 1塊(kuài)板（96T） 半(bàn)塊(kuài)板(bǎn)（48T） 即(jí)用型
塑料膜板蓋(gài) 1塊 半(bàn)塊(kuài) 即用型
標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)：80U/L 1瓶(píng)（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按說明書進行(háng)稀稀
空(kōng)白對照(zhào) 1瓶(píng)（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即(jí)用(yòng)型
標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)稀(xī)釋緩衝液 1瓶(píng)（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型(xíng)
生(shēng)物(wù)素標記的抗(kàng)HL抗(kàng)體 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
親和鏈(liàn)酶(méi)素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶(píng)（5.0ml） 即用型
洗滌緩衝液 1瓶(píng)（20ml） 1瓶(píng)（10ml） 按說(shuō)明書(shū)進行稀釋
底物A 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型
底(dǐ)物B 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型(xíng)
終止液(yè) 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型

自(zì)備材(cái)料
1． 蒸餾水。
2． 加樣(yàng)器：5ul
，10ul
，50ul
，100ul
，200
，500ul
，1000ul。
3． 振蕩(dàng)器(qì)及(jí)磁(cí)力(lì)攪拌器(qì)等。

安(ān)全(quán)性(xìng)
1． 避(bì)免直接(jiē)接觸(chù)終止液(yè)和底物A
，B。一旦(dàn)接(jiē)觸到這些(xiē)液體，請(qǐng)盡(jìn)快(kuài)用(yòng)水(shuǐ)衝洗(xǐ)。
2． 實驗中(zhōng)不要吃喝
，抽煙或(huò)使用化(huà)妝(zhuāng)品。
3． 不(bù)要用嘴(zuǐ)吸(xī)取試劑盒裏的(dí)任(rèn)何(hé)成份。

操作(zuò)注(zhù)意(yì)事(shì)項
1． 試(shì)劑應(yīng)按標簽(qiān)說明(míng)書儲存(cún)，使用前(qián)恢復到室溫(wēn)。稀稀過後(hòu)的標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)應(yīng)丟棄，不可(kě)保(bǎo)存。
2． 實驗(yàn)中(zhōng)不用的板(bǎn)條應立(lì)即放回(huí)包(bāo)裝袋(dài)中(zhōng)，密(mì)封保(bǎo)存，以(yǐ)免變(biàn)質。
3． 不用的其(qí)它試劑應包(bāo)裝(zhuāng)好(hǎo)或蓋(gài)好。不(bù)同批(pī)號的(dí)試劑不(bù)要(yào)混用(yòng)。保質(zhì)前使用。
4． 使(shǐ)用(yòng)一次(cì)性的(dí)吸(xī)頭以(yǐ)免交(jiāo)叉(chā)汙染(rǎn)，吸取終止(zhǐ)液和(hé)底物A
，B液(yè)時(shí)，避(bì)免使(shǐ)用(yòng)帶金屬部分的加樣(yàng)器。
5． 使用(yòng)幹淨(jìng)的(dí)塑料(liào)容器(qì)配(pèi)置(zhì)洗滌(dí)液(yè)。使(shǐ)用前(qián)充分混匀試(shì)劑(jì)盒(hé)裏的(dí)各(gè)種成份(fèn)及(jí)樣品。
6． 洗滌酶標(biāo)板(bǎn)時(shí)應充分拍(pāi)幹，不要(yào)將(jiāng)吸(xī)水(shuǐ)紙(zhǐ)直(zhí)接放(fàng)入(rù)酶(méi)標(biāo)反應孔中吸(xī)水。
7． 底物A應揮(huī)發(fā)，避免長(cháng)時(shí)間打開(kāi)蓋子。底(dǐ)物B對光(guāng)敏(mǐn)感，避(bì)免(miǎn)長時間暴(bào)露(lòu)於光(guāng)下。避免用(yòng)手接觸，有(yǒu)毒(dú)。實(shí)驗(yàn)完成(chéng)後(hòu)應(yīng)立即讀取(qǔ)OD值(zhí)。
8． 加入試劑(jì)的(dí)順(shùn)序(xù)應一致(zhì)，以保證(zhèng)所(suǒ)有反應(yīng)板(bǎn)孔溫育(yù)的時間一樣(yàng)。
9． 按(àn)照說(shuō)明(míng)書(shū)中標(biāo)明(míng)的(dí)時(shí)間(jiān)
，加液的(dí)量及(jí)順序進行溫(wēn)育操(cāo)作(zuò)。

樣(yàng)品收集
，處(chǔ)理及保存方法(fǎ)
1
， 血清-----操作過程(chéng)中(zhōng)避免任何細(xì)胞刺(cì)激。使用不含(hán)熱原和內(nèi)毒素(sù)的(dí)試(shì)管。收集血(xiě)液後(hòu)，1000×g離心(xīn)10分(fēn)鐘(zhōng)將(jiāng)血(xiě)清和紅細胞(bāo)迅速小心地(dì)分離。
2
， 血(xiě)漿-----EDTA
，檸檬酸(suān)鹽(yán)
，肝(gān)素血漿(jiāng)可用(yòng)於(yú)檢(jiǎn)測(cè)。1000×g離心(xīn)30分(fēn)鐘去(qù)除顆粒。
3
， 細(xì)胞上清液---1000×g離(lí)心(xīn)10分鐘去除(chú)顆粒和聚合物(wù)。
4
， 保存------如果(guǒ)樣(yàng)品不立即使用(yòng)，應將其(qí)分成小(xiǎo)部(bù)分-70 ℃保存，避免(miǎn)反(fǎn)復冷凍(dòng)。盡(jìn)可能的(dí)不(bù)要使用(yòng)溶血或高(gāo)血脂血。如果血(xiě)清(qīng)中(zhōng)大(dà)量顆(kē)粒(lì)，檢(jiǎn)測前先(xiān)離心或過(guò)濾。不要在(zài)37℃或更(gēng)高的溫(wēn)度(dù)加(jiā)熱(rè)解凍。應(yīng)在(zài)室溫下(xià)解凍並(bìng)確保(bǎo)樣品均匀地(dì)充分(fēn)解凍(dòng)。

試劑的準備(bèi)
1． 標準(zhǔn)品：標準品的係(xì)列稀(xī)釋應在(zài)實驗時(shí)準備，不(bù)能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)振(zhèn)蕩混(hùn)匀(yún)。稀釋比例按下表(biǎo)中進行：
80 U/L （6號標準品） 原倍(bèi)濃度不(bù)用(yòng)稀(xī)釋直接加入(rù)50ul。
40 U/L （5號標準(zhǔn)品） 100ul的原倍標(biāo)準品(pǐn)加入100ul的標準(zhǔn)品稀(xī)釋液
20 U/L （4號(hào)標(biāo)準品(pǐn)） 100ul的5號(hào)標準(zhǔn)品加(jiā)入100ul的標準(zhǔn)品稀釋液
10 U/L （3號標(biāo)準品） 100ul的4號標準(zhǔn)品加入100ul的標準(zhǔn)品稀釋液
5.0 U/L （2號標(biāo)準品(pǐn)） 100ul的3號標準品(pǐn)加(jiā)入(rù)100ul的(dí)標準(zhǔn)品稀(xī)釋液
2.5 U/L （1號標準(zhǔn)品(pǐn)） 100ul的(dí)2號(hào)標準(zhǔn)品加(jiā)入100ul的(dí)標準品稀(xī)釋(shì)液
0 U/L （空(kōng)白(bái)對照(zhào)） 原(yuán)始濃(nóng)度不用(yòng)稀釋直(zhí)接(jiē)加(jiā)入50ul。

2． 洗滌緩(huǎn)衝液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀(xī)釋(shì)。

操作(zuò)步(bù)驟(zhòu)
1． 使用前，將(jiāng)所(suǒ)有試劑(jì)充(chōng)分(fēn)混(hùn)匀(yún)。不要(yào)使(shǐ)液(yè)體產(chǎn)生(shēng)大量(liáng)的(dí)泡(pào)沫，以(yǐ)免加樣時加(jiā)入大(dà)量(liáng)的氣(qì)泡(pào)，產(chǎn)生(shēng)加樣(yàng)上(shàng)的(dí)誤(wù)差(chà)。
2． 根(gēn)據(jù)待(dài)測(cè)樣品(pǐn)數(shù)量加上標準(zhǔn)品的數(shù)量(liáng)決定所需的板條(tiáo)數。每(měi)個(gè)標(biāo)準品(pǐn)和空(kōng)白(bái)孔建議做復孔(kǒng)。每個(gè)樣品根(gēn)據自己的數量(liáng)來定(dìng)，能使用復(fù)孔的盡(jìn)量(liáng)做復(fù)孔(kǒng)。
3． 加入(rù)稀(xī)釋好後(hòu)的標準品(pǐn)50ul於反應(yīng)孔
，加入待(dài)測樣(yàng)品50ul於(yú)反應(yīng)孔內。立即(jí)加入50ul的(dí)生物(wù)素(sù)標(biāo)記(jì)的(dí)抗體(tǐ)。蓋上(shàng)膜板，輕輕(qīng)振(zhèn)蕩(dàng)混匀(yún)，37℃溫育1小時。
4． 甩(shuǎi)去(qù)孔內(nèi)液(yè)體，每孔加滿洗(xǐ)滌液，振蕩30秒(miǎo)，甩去(qù)洗滌(dí)液(yè)，用吸水(shuǐ)紙(zhǐ)拍幹。重(zhòng)復此(cǐ)操(cāo)作(zuò)3次。如果用(yòng)洗(xǐ)板機洗(xǐ)滌，洗(xǐ)滌次(cì)數增加(jiā)一次(cì)。
5． 每(měi)孔加(jiā)入80ul的(dí)親和鏈酶(méi)素-HRP，輕輕(qīng)振(zhèn)蕩(dàng)混(hùn)匀(yún)，37℃溫育(yù)30分(fēn)鐘(zhōng)。
6． 甩(shuǎi)去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩(shuǎi)去(qù)洗(xǐ)滌液，用(yòng)吸水(shuǐ)紙拍(pāi)幹。重(zhòng)復此操作3次。如果(guǒ)用洗(xǐ)板機洗滌(dí)，洗滌(dí)次(cì)數增加一次。
7． 每孔加(jiā)入底(dǐ)物(wù)A
，B各(gè)50ul，輕輕(qīng)振(zhèn)蕩(dàng)混匀，37℃溫育(yù)10分(fēn)鐘(zhōng)。避(bì)免(miǎn)光照(zhào)。
8． 取出(chū)酶(méi)標(biāo)板，迅速加入(rù)50ul終止液，加(jiā)入(rù)終止液(yè)後(hòu)應(yīng)立即(jí)測(cè)定(dìng)結果。
9． 在(zài)450nm波長(cháng)處測(cè)定各孔的OD值(zhí)。

建(jiàn)議(yì)使(shǐ)用的實(shí)驗(yàn)方案
 標(biāo)準品濃度（U/L） 
A 80 80 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品
B 40 40 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn)
C 20 20 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn)
D 10 10 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品
E 5.0 5.0 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn)
F 2.5 2.5 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品
G 0 0 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品
H 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品

局(jú)限
6號標準品以上(shàng)的(dí)結果(guǒ)為(wéi)非綫性(xìng)的，根據此(cǐ)標準曲綫(xiàn)無(wú)法(fǎ)得到的結果。

試劑(jì)盒(hé)性(xìng)能(néng)
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小(xiǎo)於1號(hào)標(biāo)準品(pǐn)。稀(xī)釋(shì)度的(dí)綫性。樣(yàng)品綫(xiàn)性回歸與(yǔ)預期濃度(dù)相關係(xì)數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不(bù)與人(rén)其它細(xì)胞因子反應。
3. 重復(fù)性：板(bǎn)內(nèi)
，板間變異(yì)係數(shù)均小(xiǎo)於10%。

結 果 判 斷(duàn) 與(yǔ) 分(fēn) 析
1
，儀器(qì)值：於(yú)波長450nm的酶標儀上(shàng)讀(dú)取各孔的OD值(zhí)

2
，以(yǐ)吸光度OD值為縱坐(zuò)標（Y），相應的HL標準品(pǐn)濃度(dù)為橫(héng)坐標（X），做得(dé)相應的曲(qū)綫(xiàn)，樣(yàng)品的HL含量可根(gēn)據(jù)其(qí)OD值(zhí)由標準曲綫(xiàn)換(huàn)算(suàn)出相應的濃度(dù)。

3
，檢(jiǎn)測值範(fàn)圍(wéi)：0-80U/L

4
，敏感度(dù)： 0.1 U/L