試(shì)驗原理(lǐ)：
LEC試劑(jì)盒(hé)是固相(xiāng)夾(jiā)心(xīn)法酶(méi)聯免(miǎn)疫(yì)吸(xī)附實驗（ELISA）.已(yǐ)知LEC濃度(dù)的標(biāo)準(zhǔn)品，未(wèi)知濃(nóng)度的(dí)樣(yàng)品(pǐn)加入(rù)微(wēi)孔(kǒng)酶標(biāo)板(bǎn)內(nèi)進(jìn)行(háng)檢測。先(xiān)將(jiāng)LEC和(hé)生物素(sù)標(biāo)記的抗體(tǐ)同(tóng)時溫育(yù)。洗(xǐ)滌後(hòu)，加(jiā)入(rù)親和素(sù)標(biāo)記過的(dí)HRP。再(zài)經過(guò)溫育和洗滌(dí)，去(qù)除未(wèi)結合的酶結合(hé)物，然後加入底(dǐ)物(wù)A，B，和酶(méi)結(jié)合(hé)物同時(shí)作(zuò)用(yòng)。產(chǎn)生(shēng)顏色(sè)。顏色的深淺(qiǎn)和樣(yàng)品中LEC的(dí)濃(nóng)度呈比(bǐ)例關(guān)係。

試(shì)劑盒(hé)內容及(jí)其(qí)配(pèi)製
試(shì)劑盒成份（2-8℃保(bǎo)存(cún)） 96孔(kǒng)配(pèi)置(zhì) 48孔配(pèi)置 配(pèi)製
96/48人份酶(méi)標板(bǎn) 1塊板(bǎn)（96T） 半塊(kuài)板(bǎn)（48T） 即用型(xíng)
塑料膜(mó)板蓋(gài) 1塊(kuài) 半(bàn)塊(kuài) 即用型
標準(zhǔn)品：800pg/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按說明(míng)書進行(háng)稀稀(xī)
空白(bái)對照(zhào) 1瓶(píng)（1.0ml） 1瓶(píng)（0.5ml） 即用(yòng)型(xíng)
標(biāo)準品稀(xī)釋緩衝液 1瓶(píng)（5ml） 1瓶(píng)（2.5ml） 即(jí)用(yòng)型
生(shēng)物(wù)素(sù)標(biāo)記(jì)的(dí)抗LEC抗(kàng)體(tǐ) 1瓶（6ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用(yòng)型
親和鏈酶素(sù)-HRP 1瓶（10ml） 1瓶(píng)（5.0ml） 即用型
洗(xǐ)滌緩衝液(yè) 1瓶(píng)（20ml） 1瓶(píng)（10ml） 按(àn)說明(míng)書進(jìn)行稀(xī)釋
底(dǐ)物(wù)A 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用型
底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型(xíng)
終(zhōng)止液(yè) 1瓶（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即(jí)用型

自(zì)備(bèi)材料
1． 蒸(zhēng)餾水(shuǐ)。
2． 加(jiā)樣(yàng)器(qì)：5ul，10ul，50ul，100ul，200，500ul，1000ul。
3． 振(zhèn)蕩器(qì)及(jí)磁(cí)力攪拌(bàn)器等。

安全(quán)性(xìng)
1． 避(bì)免直(zhí)接接(jiē)觸終止液(yè)和底(dǐ)物(wù)A，B。一旦接(jiē)觸到(dào)這些(xiē)液(yè)體，請盡快(kuài)用(yòng)水衝洗。
2． 實驗中不要吃(chī)喝(hē)，抽煙(yān)或(huò)使(shǐ)用(yòng)化妝(zhuāng)品。
3． 不要用嘴吸取(qǔ)試(shì)劑盒裏的任(rèn)何成份。

操作注(zhù)意(yì)事(shì)項
1． 試(shì)劑應按標(biāo)簽(qiān)說(shuō)明(míng)書儲存，使(shǐ)用前恢復(fù)到室(shì)溫。稀稀過後的標準品應丟棄，不可保(bǎo)存。
2． 實(shí)驗(yàn)中不用的板(bǎn)條應立即放回包裝袋中，密(mì)封(fēng)保存(cún)，以免(miǎn)變質。
3． 不用的其它(tā)試劑(jì)應(yīng)包裝好或(huò)蓋(gài)好(hǎo)。不(bù)同(tóng)批號的試(shì)劑不要混(hùn)用。保質前使(shǐ)用。
4． 使用(yòng)一次(cì)性(xìng)的吸頭以免交叉汙(wū)染，吸取(qǔ)終止(zhǐ)液(yè)和(hé)底物A，B液時，避(bì)免使用帶(dài)金屬部(bù)分(fēn)的(dí)加(jiā)樣器(qì)。
5． 使(shǐ)用幹淨的(dí)塑(sù)料(liào)容器(qì)配置(zhì)洗(xǐ)滌(dí)液。使用前充分(fēn)混(hùn)匀試劑(jì)盒(hé)裏的(dí)各種成(chéng)份及樣(yàng)品。
6． 洗滌酶(méi)標板(bǎn)時應(yīng)充分拍(pāi)幹，不要將吸水紙直接放入酶標反(fǎn)應孔中吸水(shuǐ)。
7． 底(dǐ)物(wù)A應(yīng)揮(huī)發(fā)，避免(miǎn)長時間打開蓋(gài)子。底物B對光敏(mǐn)感，避免(miǎn)長(cháng)時(shí)間暴露於光(guāng)下(xià)。避(bì)免(miǎn)用手接觸，有毒(dú)。實(shí)驗(yàn)完成後應立(lì)即(jí)讀取OD值。
8． 加入(rù)試(shì)劑的順序(xù)應一致，以保(bǎo)證(zhèng)所有(yǒu)反應板(bǎn)孔(kǒng)溫育的時間一樣(yàng)。
9． 按照說明(míng)書中標明(míng)的時間，加液的(dí)量(liáng)及(jí)順序進行溫育操作。

樣(yàng)品收集，處理及(jí)保(bǎo)存方(fāng)法
1， 血(xiě)清-----操作(zuò)過程中(zhōng)避免任何(hé)細胞刺激。使用(yòng)不(bù)含熱(rè)原(yuán)和內(nèi)毒(dú)素(sù)的試管(guǎn)。收集血液(yè)後(hòu)，1000×g離心(xīn)10分鐘(zhōng)將血清(qīng)和(hé)紅細胞迅速小(xiǎo)心地(dì)分離。
2， 血漿(jiāng)-----EDTA，檸(níng)檬酸(suān)鹽，肝(gān)素血漿(jiāng)可(kě)用於(yú)檢測。1000×g離(lí)心30分鐘去除顆(kē)粒。
3， 細胞上(shàng)清(qīng)液---1000×g離(lí)心10分(fēn)鐘去除顆粒和聚合物(wù)。
4， 保存------如果樣(yàng)品不立即(jí)使(shǐ)用，應將其分成小部(bù)分-70 ℃保存，避(bì)免(miǎn)反復(fù)冷凍(dòng)。盡(jìn)可能的不要使(shǐ)用溶(róng)血(xiě)或高血(xiě)脂(zhī)血(xiě)。如(rú)果(guǒ)血(xiě)清中(zhōng)大(dà)量顆粒，檢測前(qián)先(xiān)離(lí)心或過(guò)濾。不要(yào)在(zài)37℃或(huò)更(gēng)高的(dí)溫(wēn)度(dù)加(jiā)熱解(jiě)凍(dòng)。應(yīng)在室溫下(xià)解(jiě)凍並(bìng)確保(bǎo)樣品均匀(yún)地(dì)充分(fēn)解(jiě)凍(dòng)。

試劑的(dí)準備(bèi)
1． 標準(zhǔn)品(pǐn)：標(biāo)準品的係列(liè)稀(xī)釋(shì)應在實驗(yàn)時(shí)準備(bèi)，不能儲存(cún)。稀(xī)釋前(qián)將(jiāng)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)振蕩混匀。稀(xī)釋(shì)比(bǐ)例(lì)按(àn)下表(biǎo)中(zhōng)進行：
800 pg/ml （6號標(biāo)準品） 原(yuán)倍濃(nóng)度(dù)不(bù)用稀釋直接加(jiā)入50ul。
400 pg/ml （5號標準品(pǐn)） 100ul的原倍標(biāo)準品(pǐn)加入100ul的標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋液(yè)
200 pg/ml （4號(hào)標準品(pǐn)） 100ul的(dí)5號(hào)標準(zhǔn)品加入(rù)100ul的(dí)標準品稀(xī)釋(shì)液
100 pg/ml （3號標(biāo)準品） 100ul的4號(hào)標(biāo)準品加入(rù)100ul的標(biāo)準品稀(xī)釋液(yè)
50 pg/ml （2號標(biāo)準品(pǐn)） 100ul的3號(hào)標準品(pǐn)加入100ul的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)稀釋(shì)液
25 pg/ml （1號標準品(pǐn)） 100ul的(dí)2號標準品加(jiā)入100ul的(dí)標準品稀(xī)釋(shì)液(yè)
0 pg/ml （空(kōng)白(bái)對(duì)照） 原始(shǐ)濃度(dù)不用(yòng)稀(xī)釋直(zhí)接(jiē)加(jiā)入(rù)50ul。

2． 洗滌緩(huǎn)衝(chōng)液（50×）的(dí)稀釋(shì)：蒸餾(liù)水50倍稀釋(shì)。

操作步驟
1． 使(shǐ)用前，將所(suǒ)有(yǒu)試(shì)劑(jì)充分(fēn)混匀(yún)。不(bù)要(yào)使液(yè)體產生(shēng)大量的(dí)泡沫(mò)，以(yǐ)免加樣時加(jiā)入大量(liáng)的(dí)氣泡，產生(shēng)加樣(yàng)上(shàng)的誤差。
2． 根據(jù)待(dài)測樣品(pǐn)數(shù)量加(jiā)上(shàng)標準(zhǔn)品(pǐn)的數(shù)量(liáng)決(jué)定所(suǒ)需(xū)的板(bǎn)條數。每個標準(zhǔn)品和空(kōng)白(bái)孔建(jiàn)議做復孔。每個(gè)樣(yàng)品根(gēn)據自己(jǐ)的數量(liáng)來(lái)定(dìng)，能使用復(fù)孔(kǒng)的(dí)盡(jìn)量做(zuò)復(fù)孔。
3． 加(jiā)入稀釋好(hǎo)後(hòu)的標準(zhǔn)品(pǐn)50ul於反應孔(kǒng)，加(jiā)入待測樣品50ul於反(fǎn)應孔內(nèi)。立即(jí)加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體(tǐ)。蓋上(shàng)膜(mó)板，輕輕振蕩(dàng)混(hùn)匀，37℃溫(wēn)育1小時。
4． 甩(shuǎi)去(qù)孔(kǒng)內(nèi)液(yè)體，每孔加滿(mǎn)洗滌(dí)液，振蕩(dàng)30秒，甩去(qù)洗(xǐ)滌液(yè)，用吸水紙(zhǐ)拍幹(gān)。重復此操(cāo)作3次(cì)。如(rú)果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數增(zēng)加(jiā)一次(cì)。
5． 每(měi)孔(kǒng)加(jiā)入80ul的親和鏈酶(méi)素-HRP，輕輕(qīng)振蕩混匀，37℃溫育(yù)30分鐘。
6． 甩去孔內(nèi)液(yè)體(tǐ)，每(měi)孔(kǒng)加(jiā)滿(mǎn)洗(xǐ)滌(dí)液(yè)，振(zhèn)蕩30秒(miǎo)，甩(shuǎi)去洗(xǐ)滌液，用(yòng)吸(xī)水紙拍(pāi)幹。重(zhòng)復此操(cāo)作3次。如(rú)果(guǒ)用洗(xǐ)板機洗(xǐ)滌，洗滌(dí)次(cì)數(shù)增加(jiā)一次。
7． 每(měi)孔加入底(dǐ)物(wù)A，B各(gè)50ul，輕輕振(zhèn)蕩混匀(yún)，37℃溫(wēn)育(yù)10分鐘。避免光(guāng)照(zhào)。
8． 取出酶(méi)標(biāo)板(bǎn)，迅(xùn)速加入(rù)50ul終(zhōng)止液(yè)，加入終(zhōng)止液後(hòu)應(yīng)立即測(cè)定(dìng)結果(guǒ)。
9． 在(zài)450nm波(bō)長處(chǔ)測定各孔(kǒng)的OD值(zhí)。

建(jiàn)議使(shǐ)用(yòng)的(dí)實驗方案
 標準(zhǔn)品濃(nóng)度（pg/ml） 
A 800 800 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn)
B 400 400 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn)
C 200 200 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品
D 100 100 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣品
E 50 50 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品
F 25 25 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn)
G 0 0 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品
H 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品

局限(xiàn)
6號(hào)標準品以上的結果(guǒ)為(wéi)非綫性(xìng)的(dí)，根據(jù)此(cǐ)標準(zhǔn)曲(qū)綫無(wú)法(fǎ)得到的(dí)結果。

試(shì)劑盒(hé)性能
1. 靈敏(mǐn)度：zui小的檢(jiǎn)測(cè)濃(nóng)度(dù)小(xiǎo)於1號標(biāo)準品(pǐn)。稀釋度(dù)的綫性。樣(yàng)品綫性回歸與(yǔ)預(yù)期濃度相關係(xì)數R值(zhí)為(wéi)0.990。
2. 特異性：不與其它細胞(bāo)因(yīn)子(zǐ)反(fǎn)應。
3. 重(zhòng)復(fù)性：板內(nèi)，板(bǎn)間(jiān)變(biàn)異(yì)係數均(jūn)小於(yú)10%。

結 果(guǒ) 判(pàn) 斷(duàn) 與 分 析(xī)
1，儀(yí)器值：於波長450nm的酶標(biāo)儀(yí)上(shàng)讀取各(gè)孔的OD值

2，以(yǐ)吸光度OD值(zhí)為縱(zòng)坐標(biāo)（Y），相(xiāng)應的LEC標準品濃(nóng)度(dù)為(wéi)橫(héng)坐(zuò)標（X），做得相(xiāng)應的(dí)曲綫，樣品的(dí)LEC含(hán)量可根據其(qí)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲(qū)綫換算出(chū)相(xiāng)應(yīng)的(dí)濃度(dù)。

3，檢測值(zhí)範圍：0-800pg/ml

4，敏(mǐn)感度(dù)： 1.0 pg/ml