試驗原理(lǐ)：
E2試劑盒是固(gù)相夾(jiā)心法(fǎ)酶聯(lián)免(miǎn)疫吸(xī)附實(shí)驗（ELISA）.已(yǐ)知E2濃度(dù)的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品，未知濃度的樣品(pǐn)加入(rù)微孔酶(méi)標板(bǎn)內進(jìn)行(háng)檢(jiǎn)測
。先將E2和(hé)生物素標記的(dí)抗體(tǐ)同(tóng)時溫育(yù)
。洗滌後，加(jiā)入(rù)親和素(sù)標記過的(dí)HRP
。再(zài)經(jīng)過溫(wēn)育(yù)和(hé)洗滌，去(qù)除(chú)未(wèi)結合的酶(méi)結合(hé)物(wù)，然後加入底(dǐ)物A，B，和酶結合物同時(shí)作用
。產(chǎn)生顏(yán)色
。顏(yán)色(sè)的深淺(qiǎn)和(hé)樣(yàng)品中E2的(dí)濃度(dù)呈(chéng)比例關(guān)係
。

試劑盒(hé)內容及(jí)其配製
試劑盒(hé)成份（2-8℃保存） 96孔配置(zhì) 48孔配(pèi)置 配製(zhì)
96/48人(rén)份(fèn)酶(méi)標(biāo)板(bǎn) 1塊板（96T） 半(bàn)塊板(bǎn)（48T） 即(jí)用型
塑(sù)料(liào)膜板蓋(gài) 1塊(kuài) 半塊 即(jí)用(yòng)型(xíng)
標(biāo)準品(pǐn)：400pmol/L 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按(àn)說(shuō)明(míng)書進行(háng)稀(xī)稀(xī)
空白對照(zhào) 1瓶（1.0ml） 1瓶(píng)（0.5ml） 即(jí)用(yòng)型
標(biāo)準品(pǐn)稀釋(shì)緩衝(chōng)液 1瓶(píng)（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型
生物素(sù)標記的(dí)抗E2抗(kàng)體 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型
親和(hé)鏈(liàn)酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶(píng)（5.0ml） 即用型
洗(xǐ)滌緩衝液 1瓶(píng)（20ml） 1瓶（10ml） 按說明書進行(háng)稀釋
底(dǐ)物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型(xíng)
底物(wù)B 1瓶（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用(yòng)型
終(zhōng)止液(yè) 1瓶（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用(yòng)型(xíng)

自備(bèi)材料
1． 蒸(zhēng)餾水
。
2． 加樣(yàng)器：5ul，10ul，50ul，100ul，200ul，500ul，1000ul
。
3． 振蕩(dàng)器(qì)及(jí)磁(cí)力攪拌器(qì)等
。

安(ān)全性
1． 避(bì)免直接接觸(chù)終(zhōng)止(zhǐ)液和(hé)底物(wù)A，B
。一(yī)旦接(jiē)觸(chù)到這些(xiē)液體(tǐ)，請盡快(kuài)用(yòng)水衝洗
。
2． 實驗(yàn)中不要吃喝，抽煙或使用(yòng)化妝品
。
3． 不要(yào)用嘴吸取試劑(jì)盒裏(lǐ)的任(rèn)何成(chéng)份
。

操作注意事項
1． 試(shì)劑應按標(biāo)簽說明書儲存(cún)，使(shǐ)用前恢復(fù)到室溫
。稀稀(xī)過(guò)後(hòu)的標準品(pǐn)應(yīng)丟(diū)棄，不可保存
。
2． 實(shí)驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋(dài)中(zhōng)，密(mì)封(fēng)保(bǎo)存，以免變質
。
3． 不用的其(qí)它試劑應包(bāo)裝好(hǎo)或蓋好(hǎo)
。不同批(pī)號的(dí)試劑不(bù)要混(hùn)用
。保質(zhì)前使用(yòng)
。
4． 使(shǐ)用一次(cì)性的(dí)吸(xī)頭以(yǐ)免交叉汙(wū)染，吸取終止(zhǐ)液和底物A，B液時，避免(miǎn)使(shǐ)用帶金屬部分(fēn)的加樣器
。
5． 使用幹(gān)淨的(dí)塑料容(róng)器配(pèi)置(zhì)洗滌液
。使用前充分(fēn)混匀試劑盒裏的各(gè)種(zhǒng)成份及(jí)樣品
。
6． 洗滌酶標(biāo)板(bǎn)時(shí)應充(chōng)分拍幹，不要將吸(xī)水(shuǐ)紙直(zhí)接(jiē)放(fàng)入酶標反(fǎn)應(yīng)孔中吸(xī)水
。
7． 底(dǐ)物A應(yīng)揮發，避免(miǎn)長時間(jiān)打開蓋子
。底(dǐ)物(wù)B對光敏感，避免(miǎn)長(cháng)時間暴(bào)露(lòu)於光下
。避免用手接觸(chù)，有毒(dú)
。實(shí)驗(yàn)完成(chéng)後應立即(jí)讀取OD值
。
8． 加入(rù)試劑(jì)的(dí)順序(xù)應(yīng)一(yī)致(zhì)，以(yǐ)保證所有(yǒu)反應(yīng)板孔(kǒng)溫育(yù)的時間(jiān)一(yī)樣(yàng)
。
9． 按(àn)照說明(míng)書中(zhōng)標(biāo)明的時間(jiān)，加(jiā)液的(dí)量(liáng)及順序進行溫(wēn)育操(cāo)作
。

樣(yàng)品(pǐn)收集(jí)，處(chǔ)理及保存方法
1， 血清-----操作(zuò)過程(chéng)中(zhōng)避免(miǎn)任何細胞(bāo)刺(cì)激(jī)
。使用(yòng)不含熱原和內毒(dú)素(sù)的(dí)試(shì)管
。收集血液(yè)後(hòu)，1000×g離(lí)心10分(fēn)鐘將血清和紅細(xì)胞(bāo)迅速小心地分離
。
2， 血(xiě)漿(jiāng)-----EDTA，檸檬酸鹽(yán)，肝(gān)素血漿(jiāng)可(kě)用於檢測
。1000×g離(lí)心30分(fēn)鐘(zhōng)去除顆粒
。
3， 細(xì)胞(bāo)上清液---1000×g離(lí)心10分鐘去(qù)除顆粒(lì)和聚(jù)合(hé)物
。
4， 保存(cún)------如果樣品不(bù)立即(jí)使用，應將(jiāng)其分成小部分(fēn)-70 ℃保存(cún)，避(bì)免反復(fù)冷(lěng)凍
。盡可(kě)能的(dí)不要使用溶血或(huò)高血(xiě)脂血
。如(rú)果血(xiě)清中大(dà)量顆(kē)粒(lì)，檢(jiǎn)測(cè)前(qián)先(xiān)離心或過濾
。不要(yào)在(zài)37℃或更高的溫(wēn)度加(jiā)熱解凍(dòng)
。應(yīng)在室(shì)溫下解凍(dòng)並確保樣(yàng)品(pǐn)均匀地充分(fēn)解凍(dòng)
。

試(shì)劑的(dí)準備
1． 標準(zhǔn)品(pǐn)：標準(zhǔn)品的(dí)係(xì)列(liè)稀(xī)釋應在(zài)實(shí)驗時準備(bèi)，不能儲存
。稀釋前(qián)將標準品振(zhèn)蕩混匀(yún)
。稀(xī)釋比例按下表(biǎo)中進行(háng)：
400 pmol/L （6號標準(zhǔn)品(pǐn)） 原(yuán)倍(bèi)濃(nóng)度(dù)不用稀(xī)釋(shì)直接(jiē)加(jiā)入(rù)50ul
。
200 pmol/L （5號標準品） 100ul的原(yuán)倍標(biāo)準(zhǔn)品加入(rù)100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀(xī)釋液
100 pmol/L （4號標準(zhǔn)品） 100ul的5號(hào)標(biāo)準品(pǐn)加(jiā)入100ul的(dí)標準(zhǔn)品稀釋液(yè)
50 pmol/L （3號標準(zhǔn)品(pǐn)） 100ul的4號標準品加(jiā)入(rù)100ul的標(biāo)準品(pǐn)稀釋(shì)液(yè)
25 pmol/L （2號標準品） 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加(jiā)入(rù)100ul的標準品稀釋液
12.5 pmol/L （1號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的2號標(biāo)準品加入100ul的(dí)標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋(shì)液
0 pmol/L （空白對(duì)照） 原始濃度(dù)不(bù)用稀釋(shì)直(zhí)接(jiē)加(jiā)入50ul
。

2． 洗滌(dí)緩(huǎn)衝液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀(xī)釋
。

操(cāo)作步驟(zhòu)
1． 使用(yòng)前，將(jiāng)所有試劑(jì)充(chōng)分混匀
。不要使(shǐ)液體產生大量(liáng)的泡(pào)沫(mò)，以(yǐ)免(miǎn)加(jiā)樣(yàng)時加入大(dà)量的氣泡(pào)，產(chǎn)生(shēng)加樣上的誤差(chà)
。
2． 根據(jù)待(dài)測樣(yàng)品數量加上標(biāo)準品的數量(liáng)決定所需(xū)的板條數(shù)
。每(měi)個標準(zhǔn)品和空白(bái)孔(kǒng)建議做復(fù)孔(kǒng)
。每個樣(yàng)品(pǐn)根(gēn)據自己(jǐ)的數(shù)量來定，能(néng)使(shǐ)用復孔(kǒng)的盡量做復孔
。
3． 加入稀(xī)釋好後的標(biāo)準品(pǐn)50ul於反應(yīng)孔，加(jiā)入待測樣品(pǐn)50ul於反應(yīng)孔(kǒng)內
。立即(jí)加(jiā)入50ul的(dí)生物素(sù)標記的抗(kàng)體(tǐ)
。蓋上(shàng)膜板，輕輕振蕩混(hùn)匀(yún)，37℃溫育1小時
。
4． 甩去孔(kǒng)內液體(tǐ)，每(měi)孔加滿洗滌液(yè)，振蕩30秒(miǎo)，甩(shuǎi)去洗滌液，用(yòng)吸水紙(zhǐ)拍幹(gān)
。重復(fù)此(cǐ)操作3次(cì)
。如果(guǒ)用洗(xǐ)板(bǎn)機洗滌(dí)，洗滌次數增(zēng)加一(yī)次
。
5． 每(měi)孔加入(rù)80ul的親(qīn)和鏈酶素(sù)-HRP，輕輕振(zhèn)蕩混(hùn)匀，37℃溫育30分鐘
。
6． 甩去孔內液體(tǐ)，每孔(kǒng)加(jiā)滿洗滌(dí)液(yè)，振蕩(dàng)30秒，甩去洗(xǐ)滌液，用吸水紙拍幹
。重復(fù)此操(cāo)作(zuò)3次
。如果(guǒ)用(yòng)洗板(bǎn)機(jī)洗(xǐ)滌，洗(xǐ)滌(dí)次數增(zēng)加(jiā)一次(cì)
。
7． 每孔加(jiā)入底物(wù)A，B各(gè)50ul，輕輕(qīng)振蕩(dàng)混匀，37℃溫(wēn)育10分鐘
。避免光照
。
8． 取(qǔ)出(chū)酶標(biāo)板，迅(xùn)速(sù)加入50ul終止液，加(jiā)入(rù)終止(zhǐ)液後(hòu)應立即測定(dìng)結果(guǒ)
。
9． 在(zài)450nm波長處(chǔ)測定各孔(kǒng)的(dí)OD值
。

建(jiàn)議使用的實(shí)驗方案(àn)
 標(biāo)準品(pǐn)濃度（pmol/L） 
A 400 400 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn)
B 200 200 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn)
C 100 100 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn)
D 50 50 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品
E 25 25 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn)
F 12.5 12.5 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn)
G 0 0 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品
H 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品

局(jú)限
6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結果為非(fēi)綫(xiàn)性的，根據(jù)此標準曲(qū)綫(xiàn)無(wú)法得到的結果
。

試劑盒性(xìng)能(néng)
1. 靈敏(mǐn)度：zui小(xiǎo)的(dí)檢測濃(nóng)度小於(yú)1號標準(zhǔn)品
。稀釋(shì)度(dù)的綫性(xìng)
。樣品綫性回(huí)歸與(yǔ)預期濃(nóng)度相(xiāng)關係數R值為(wéi)0.990
。
2. 特異(yì)性：不(bù)與其(qí)它(tā)細(xì)胞因(yīn)子(zǐ)反應
。
3. 重復性：板(bǎn)內，板間變異(yì)係(xì)數均(jūn)小於10%
。

結(jié) 果(guǒ) 判(pàn) 斷(duàn) 與(yǔ) 分 析
1，儀器值：於(yú)波(bō)長450nm的酶標儀上(shàng)讀取(qǔ)各孔的OD值

2，以吸光度(dù)OD值(zhí)為縱坐(zuò)標（Y），相應的E2標準品(pǐn)濃度為橫(héng)坐標(biāo)（X），做(zuò)得相應的(dí)曲綫，樣品(pǐn)的(dí)E2含量(liáng)可根(gēn)據(jù)其(qí)OD值由(yóu)標(biāo)準(zhǔn)曲綫換算(suàn)出相(xiāng)應(yīng)的(dí)濃度
。

3，檢測值範圍(wéi)：0-400pmol/L

4，敏(mǐn)感度(dù)： 1.0 pmol/L