大鼠(shǔ) （Rat） P-選擇素(sù) （P-selectin） ELISA 檢(jiǎn)測試劑盒
本試(shì)劑僅供(gōng)研究(jiū)使(shǐ)用(yòng) 標(biāo)本：血(xiě)清或血(xiě)漿(jiāng)

試驗原理：
P-selectin試劑盒(hé)是(shì)固相夾(jiā)心法酶(méi)聯免疫(yì)吸附(fù)實驗(yàn)（ELISA）.已知(zhī)P-selectin濃(nóng)度(dù)的標(biāo)準品，未知濃度(dù)的樣品加(jiā)入(rù)微孔(kǒng)酶標(biāo)板內(nèi)進行檢測。先(xiān)將P-selectin和生物(wù)素標(biāo)記的抗體同(tóng)時溫育(yù)。洗滌後(hòu)，加入親(qīn)和素標記過的(dí)HRP。再(zài)經過溫育(yù)和(hé)洗(xǐ)滌(dí)，去(qù)除未結合(hé)的酶結合(hé)物(wù)，然(rán)後加入底物A，B，和酶(méi)結(jié)合物(wù)同時(shí)作(zuò)用。產生(shēng)顏(yán)色(sè)。顏色的深淺和樣品中P-selectin的(dí)濃度呈(chéng)比(bǐ)例關係。

試(shì)劑盒(hé)內(nèi)容(róng)及(jí)其配製
試劑盒成(chéng)份(fèn)（2-8℃保存） 96孔(kǒng)配置 48孔配(pèi)置 配(pèi)製(zhì)
96/48人份酶標(biāo)板(bǎn) 1塊(kuài)板(bǎn)（96T） 半塊板（48T） 即用(yòng)型
塑(sù)料膜(mó)板蓋 1塊(kuài) 半(bàn)塊 即(jí)用(yòng)型
標準(zhǔn)品：400ng/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按說(shuō)明(míng)書進行(háng)稀稀(xī)
空白對照 1瓶（1.0ml） 1瓶(píng)（0.5ml） 即用型
標準(zhǔn)品稀(xī)釋緩衝液(yè) 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型
生(shēng)物素(sù)標(biāo)記(jì)的抗P-selectin抗體 1瓶(píng)（6ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用型(xíng)
親(qīn)和(hé)鏈酶素(sù)-HRP 1瓶(píng)（10ml） 1瓶(píng)（5.0ml） 即用型
洗滌(dí)緩衝液 1瓶（20ml） 1瓶(píng)（10ml） 按(àn)說明書(shū)進(jìn)行稀釋
底物(wù)A 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即(jí)用型(xíng)
底(dǐ)物B 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型(xíng)
終止液 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型(xíng)

自(zì)備材(cái)料
1． 蒸餾(liù)水(shuǐ)。
2． 加樣(yàng)器：5ul，10ul，50ul，100ul，200ul，500ul，1000ul。
3． 振(zhèn)蕩(dàng)器及磁(cí)力攪(jiǎo)拌(bàn)器等。

安全(quán)性(xìng)
1． 避免直(zhí)接接(jiē)觸終止(zhǐ)液和底物(wù)A，B。一旦接觸到(dào)這些液體，請盡快用水衝洗。
2． 實驗(yàn)中(zhōng)不要吃喝，抽(chōu)煙或使用(yòng)化(huà)妝品。
3． 不要用嘴吸(xī)取(qǔ)試劑盒裏(lǐ)的任何成(chéng)份(fèn)。

操作注意事(shì)項(xiàng)
1． 試劑(jì)應按標簽(qiān)說明書儲(chǔ)存，使用前(qián)恢(huī)復到室溫。稀稀過後(hòu)的(dí)標(biāo)準品應(yīng)丟棄，不(bù)可保存。
2． 實驗中不用(yòng)的板條(tiáo)應(yīng)立即放回包裝袋(dài)中，密封保存，以免(miǎn)變(biàn)質。
3． 不(bù)用的(dí)其(qí)它試劑(jì)應包裝好或(huò)蓋好。不同(tóng)批號的(dí)試劑(jì)不(bù)要(yào)混用(yòng)。保(bǎo)質(zhì)前使用。
4． 使(shǐ)用一次性(xìng)的(dí)吸頭(tóu)以免交叉汙染(rǎn)，吸取(qǔ)終止液和(hé)底(dǐ)物A，B液時，避(bì)免(miǎn)使用帶(dài)金屬部(bù)分的(dí)加(jiā)樣器。
5． 使用幹淨(jìng)的塑料容器配(pèi)置洗(xǐ)滌液。使(shǐ)用前充分混(hùn)匀試劑盒裏的各種成份及樣(yàng)品。
6． 洗(xǐ)滌酶標(biāo)板時應充(chōng)分拍(pāi)幹，不(bù)要將(jiāng)吸水紙(zhǐ)直接放(fàng)入酶(méi)標(biāo)反應(yīng)孔中吸水(shuǐ)。
7． 底(dǐ)物(wù)A應揮發，避免(miǎn)長時(shí)間打開(kāi)蓋子。底(dǐ)物B對(duì)光(guāng)敏感(gǎn)，避免(miǎn)長時間暴(bào)露於光(guāng)下。避免(miǎn)用手(shǒu)接觸(chù)，有(yǒu)毒(dú)。實驗(yàn)完成(chéng)後(hòu)應(yīng)立即讀取(qǔ)OD值。
8． 加入(rù)試劑(jì)的(dí)順(shùn)序應一致，以(yǐ)保證所(suǒ)有反(fǎn)應板(bǎn)孔溫育(yù)的時間一樣。
9． 按照說(shuō)明(míng)書中標(biāo)明(míng)的時間(jiān)，加液(yè)的(dí)量及(jí)順序進行溫育操(cāo)作(zuò)。

樣品(pǐn)收(shōu)集，處理及(jí)保(bǎo)存(cún)方(fāng)法
1， 血清(qīng)-----操作(zuò)過(guò)程(chéng)中(zhōng)避免任(rèn)何細(xì)胞(bāo)刺(cì)激。使用不含(hán)熱原(yuán)和(hé)內(nèi)毒素的試管。收集血(xiě)液後，1000×g離(lí)心10分(fēn)鐘將(jiāng)血(xiě)清(qīng)和(hé)紅細胞迅速(sù)小(xiǎo)心(xīn)地分離。
2， 血(xiě)漿-----EDTA，檸檬酸鹽，肝素(sù)血漿可用(yòng)於檢(jiǎn)測。1000×g離心(xīn)30分鐘去(qù)除(chú)顆粒。
3， 細胞(bāo)上清液---1000×g離(lí)心10分(fēn)鐘去(qù)除(chú)顆粒(lì)和(hé)聚合物。
4， 保(bǎo)存------如果樣(yàng)品(pǐn)不立(lì)即(jí)使用(yòng)，應將(jiāng)其分成(chéng)小(xiǎo)部分-70 ℃保存，避免(miǎn)反復冷凍(dòng)。盡(jìn)可能(néng)的不(bù)要(yào)使(shǐ)用溶血或高(gāo)血脂血。如果(guǒ)血清(qīng)中(zhōng)大量顆粒，檢測前(qián)先離心或(huò)過(guò)濾。不(bù)要(yào)在37℃或(huò)更(gēng)高的(dí)溫度(dù)加熱解(jiě)凍(dòng)。應在室溫(wēn)下(xià)解(jiě)凍並確保樣(yàng)品均匀地充分解(jiě)凍(dòng)。

試(shì)劑(jì)的準備
1． 標準(zhǔn)品(pǐn)：標準(zhǔn)品(pǐn)的係(xì)列稀釋應在實(shí)驗(yàn)時(shí)準備，不能(néng)儲(chǔ)存。稀釋前將標準品振(zhèn)蕩混匀。稀釋(shì)比例(lì)按(àn)下表(biǎo)中進(jìn)行：
400 ng/ml （6號標準品） 原倍(bèi)濃度(dù)不(bù)用稀釋(shì)直接加(jiā)入50ul。
200 ng/ml （5號(hào)標(biāo)準品） 100ul的原倍標準品(pǐn)加(jiā)入(rù)100ul的(dí)標準(zhǔn)品(pǐn)稀釋液
100 ng/ml （4號(hào)標準品(pǐn)） 100ul的(dí)5號標準(zhǔn)品加入100ul的(dí)標準品(pǐn)稀釋(shì)液(yè)
50 ng/ml （3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的4號標(biāo)準品(pǐn)加(jiā)入100ul的標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋液(yè)
25 ng/ml （2號標(biāo)準品） 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入(rù)100ul的(dí)標準品稀(xī)釋液
12.5 ng/ml （1號標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)） 100ul的2號(hào)標準品(pǐn)加(jiā)入100ul的(dí)標準品稀(xī)釋(shì)液(yè)
0 ng/ml （空(kōng)白(bái)對照） 原始濃(nóng)度不(bù)用稀釋直(zhí)接加(jiā)入(rù)50ul。

2． 洗(xǐ)滌緩衝液(yè)（50×）的(dí)稀釋(shì)：蒸餾(liù)水(shuǐ)50倍稀(xī)釋。

操作(zuò)步驟
1． 使(shǐ)用(yòng)前(qián)，將(jiāng)所有試(shì)劑充(chōng)分(fēn)混匀。不要(yào)使液(yè)體產(chǎn)生大量的(dí)泡沫，以免(miǎn)加樣時加入大量(liáng)的氣(qì)泡，產(chǎn)生加樣(yàng)上(shàng)的誤差。
2． 根據待(dài)測(cè)樣品(pǐn)數量加上(shàng)標準(zhǔn)品(pǐn)的數量決定所需(xū)的(dí)板(bǎn)條(tiáo)數(shù)。每(měi)個標準(zhǔn)品(pǐn)和(hé)空(kōng)白(bái)孔(kǒng)建(jiàn)議(yì)做復孔。每個(gè)樣品根(gēn)據自己(jǐ)的數量(liáng)來(lái)定，能使用(yòng)復(fù)孔(kǒng)的(dí)盡量做復孔(kǒng)。
3． 加入(rù)稀釋(shì)好後的標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)50ul於反應孔，加入待(dài)測樣品50ul於(yú)反(fǎn)應孔內(nèi)。立即加(jiā)入50ul的生(shēng)物素(sù)標記的(dí)抗體(tǐ)。蓋上(shàng)膜板，輕輕振蕩(dàng)混(hùn)匀(yún)，37℃溫育(yù)1小(xiǎo)時。
4． 甩去(qù)孔內液體，每(měi)孔加滿(mǎn)洗滌液(yè)，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水(shuǐ)紙拍(pāi)幹(gān)。重復此操作(zuò)3次(cì)。如果用洗(xǐ)板(bǎn)機(jī)洗滌，洗(xǐ)滌次(cì)數(shù)增加(jiā)一次。
5． 每孔加入80ul的(dí)親和鏈(liàn)酶素(sù)-HRP，輕輕振蕩混(hùn)匀，37℃溫育(yù)30分鐘。
6． 甩(shuǎi)去孔內液體(tǐ)，每(měi)孔(kǒng)加滿(mǎn)洗滌液(yè)，振(zhèn)蕩(dàng)30秒，甩去洗滌(dí)液(yè)，用(yòng)吸(xī)水紙拍幹。重復(fù)此(cǐ)操作(zuò)3次(cì)。如果用(yòng)洗板(bǎn)機(jī)洗(xǐ)滌，洗(xǐ)滌次數(shù)增加(jiā)一次。
7． 每孔(kǒng)加入底物A，B各50ul，輕(qīng)輕振蕩混匀(yún)，37℃溫育(yù)10分鐘。避(bì)免(miǎn)光照(zhào)。
8． 取(qǔ)出(chū)酶標板，迅速(sù)加入50ul終(zhōng)止(zhǐ)液，加入終(zhōng)止液後應(yīng)立即測定(dìng)結果。
9． 在(zài)450nm波長(cháng)處測(cè)定各(gè)孔的(dí)OD值。

建議(yì)使用的(dí)實驗(yàn)方案(àn)
 標準品濃(nóng)度(dù)（ng/ml） 
A 400 400 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品
B 200 200 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品
C 100 100 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品
D 50 50 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn)
E 25 25 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn)
F 12.5 12.5 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品
G 0 0 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn)
H 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn)

局(jú)限
6號(hào)標(biāo)準品以上(shàng)的(dí)結(jié)果為非綫性的，根(gēn)據(jù)此標準曲(qū)綫(xiàn)無法得(dé)到的結(jié)果。

試(shì)劑(jì)盒性(xìng)能
1. 靈(líng)敏度(dù)：zui小的檢測(cè)濃度小於1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀(xī)釋度的綫性(xìng)。樣(yàng)品綫(xiàn)性回(huí)歸(guī)與預(yù)期濃(nóng)度相關(guān)係數R值為0.990。
2. 特異(yì)性(xìng)：不與(yǔ)其它細胞(bāo)因子(zǐ)反(fǎn)應(yīng)。
3. 重(zhòng)復(fù)性(xìng)：板(bǎn)內，板間變異係(xì)數均小(xiǎo)於10%。

結 果(guǒ) 判 斷(duàn) 與(yǔ) 分(fēn) 析
1，儀(yí)器(qì)值(zhí)：於波長(cháng)450nm的酶標儀(yí)上(shàng)讀(dú)取(qǔ)各(gè)孔的OD值(zhí)

2，以(yǐ)吸光度(dù)OD值為(wéi)縱坐標（Y），相(xiāng)應的P-selectin標(biāo)準品濃度(dù)為(wéi)橫坐標(biāo)（X），做得相(xiāng)應的曲綫，樣(yàng)品的P-selectin含量(liáng)可根據其(qí)OD值(zhí)由(yóu)標準(zhǔn)曲綫(xiàn)換算(suàn)出相(xiāng)應(yīng)的濃(nóng)度。

3，檢測(cè)值範(fàn)圍：0-400ng/ml

4，敏(mǐn)感度(dù)： 1.0 ng/ml