大(dà)鼠 （Rat） E-選(xuǎn)擇素（E-selectin）ELISA 檢測試劑(jì)盒
本(běn)試劑僅(jǐn)供(gōng)研究使(shǐ)用 標(biāo)本：血清(qīng)或(huò)血漿

試(shì)驗原理(lǐ)：
E-selectin試劑盒(hé)是固相夾(jiā)心法酶聯(lián)免(miǎn)疫吸附實驗（ELISA）.已知E-selectin濃度的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品，未知濃(nóng)度的樣品加入(rù)微孔酶標板(bǎn)內進行檢測(cè)。先將E-selectin和生物素(sù)標記的(dí)抗體(tǐ)同時溫(wēn)育(yù)。洗滌後，加入(rù)親和素(sù)標(biāo)記(jì)過的HRP。再(zài)經過溫(wēn)育和(hé)洗(xǐ)滌，去除未結(jié)合的酶結合物，然後(hòu)加(jiā)入底(dǐ)物A，B，和酶結(jié)合(hé)物同(tóng)時作(zuò)用。產(chǎn)生顏色。顏(yán)色的深(shēn)淺和樣品中E-selectin的濃(nóng)度呈比(bǐ)例關(guān)係(xì)。

試劑(jì)盒內容(róng)及(jí)其配(pèi)製
試(shì)劑(jì)盒(hé)成份（2-8℃保存） 96孔(kǒng)配置 48孔(kǒng)配置(zhì) 配製(zhì)
96/48人份酶(méi)標(biāo)板 1塊板(bǎn)（96T） 半(bàn)塊板（48T） 即用型
塑料(liào)膜(mó)板(bǎn)蓋(gài) 1塊 半(bàn)塊 即用(yòng)型
標準品：240ng/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按說(shuō)明書進行稀稀
空(kōng)白對照 1瓶(píng)（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即(jí)用(yòng)型(xíng)
標準(zhǔn)品稀(xī)釋(shì)緩(huǎn)衝液(yè) 1瓶(píng)（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用(yòng)型
生(shēng)物(wù)素(sù)標(biāo)記的(dí)抗E-selectin抗體(tǐ) 1瓶（6ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即(jí)用型
親和鏈酶素(sù)-HRP 1瓶(píng)（10ml） 1瓶（5.0ml） 即(jí)用(yòng)型
洗滌緩衝(chōng)液 1瓶（20ml） 1瓶(píng)（10ml） 按(àn)說明(míng)書進(jìn)行稀釋(shì)
底物A 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即(jí)用型(xíng)
底物B 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用型(xíng)
終(zhōng)止(zhǐ)液(yè) 1瓶（6.0ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用型(xíng)

自備(bèi)材料
1． 蒸(zhēng)餾水。
2． 加樣器：5ul，10ul，50ul，100ul，200，500ul，1000ul。
3． 振(zhèn)蕩器及磁(cí)力(lì)攪拌器等。

安(ān)全性
1． 避(bì)免直(zhí)接接(jiē)觸終(zhōng)止液(yè)和(hé)底物A，B。一旦(dàn)接(jiē)觸到這些液體，請盡(jìn)快(kuài)用水(shuǐ)衝洗。
2． 實驗(yàn)中(zhōng)不要吃(chī)喝，抽(chōu)煙或(huò)使(shǐ)用(yòng)化(huà)妝(zhuāng)品。
3． 不(bù)要用(yòng)嘴吸取(qǔ)試劑盒(hé)裏(lǐ)的(dí)任(rèn)何(hé)成(chéng)份。

操作注(zhù)意(yì)事項(xiàng)
1． 試劑(jì)應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲存，使(shǐ)用(yòng)前恢(huī)復(fù)到(dào)室溫(wēn)。稀稀(xī)過後的(dí)標(biāo)準品應(yīng)丟棄，不(bù)可保存。
2． 實驗中不用的板條應(yīng)立即(jí)放(fàng)回(huí)包(bāo)裝袋(dài)中(zhōng)，密封保(bǎo)存(cún)，以免變質(zhì)。
3． 不用的(dí)其(qí)它(tā)試劑應(yīng)包裝好(hǎo)或(huò)蓋好。不同(tóng)批號(hào)的試劑(jì)不要混用(yòng)。保質前使用。
4． 使(shǐ)用一(yī)次(cì)性(xìng)的吸(xī)頭(tóu)以(yǐ)免(miǎn)交(jiāo)叉(chā)汙染(rǎn)，吸(xī)取終止液(yè)和底(dǐ)物A，B液時，避免(miǎn)使(shǐ)用帶(dài)金屬部分的加樣(yàng)器(qì)。
5． 使(shǐ)用幹淨的(dí)塑(sù)料(liào)容器配置(zhì)洗滌(dí)液(yè)。使(shǐ)用前充(chōng)分混匀試劑(jì)盒裏(lǐ)的(dí)各種成份及(jí)樣品。
6． 洗滌酶(méi)標板(bǎn)時應充分拍幹，不要(yào)將吸水(shuǐ)紙直接放入酶標反應(yīng)孔(kǒng)中(zhōng)吸水(shuǐ)。
7． 底(dǐ)物A應(yīng)揮發，避免長(cháng)時間(jiān)打開蓋子。底物B對(duì)光(guāng)敏(mǐn)感(gǎn)，避(bì)免(miǎn)長時間(jiān)暴露於(yú)光下。避免(miǎn)用手(shǒu)接(jiē)觸，有毒(dú)。實(shí)驗完成後應立即讀(dú)取OD值。
8． 加入(rù)試劑的順序應(yīng)一(yī)致(zhì)，以(yǐ)保證所有反(fǎn)應(yīng)板孔(kǒng)溫(wēn)育(yù)的時(shí)間(jiān)一(yī)樣。
9． 按(àn)照(zhào)說(shuō)明(míng)書(shū)中標明的(dí)時間，加(jiā)液的(dí)量(liáng)及順(shùn)序(xù)進(jìn)行溫育(yù)操作(zuò)。

樣品收(shōu)集，處理及保存方(fāng)法
1， 血清(qīng)-----操作(zuò)過程中(zhōng)避(bì)免(miǎn)任(rèn)何細(xì)胞(bāo)刺激。使用(yòng)不含熱原和內毒(dú)素(sù)的(dí)試(shì)管。收(shōu)集血(xiě)液(yè)後，1000×g離心10分(fēn)鐘(zhōng)將血清和紅細胞迅速小心地分(fēn)離(lí)。
2， 血(xiě)漿-----EDTA，檸(níng)檬(méng)酸(suān)鹽(yán)，肝(gān)素血漿可(kě)用(yòng)於檢測(cè)。1000×g離心30分(fēn)鐘去(qù)除(chú)顆粒。
3， 細(xì)胞(bāo)上清液---1000×g離(lí)心10分鐘去(qù)除(chú)顆(kē)粒和聚(jù)合(hé)物。
4， 保(bǎo)存------如果樣(yàng)品不立即使用，應將(jiāng)其(qí)分成小部分(fēn)-70 ℃保存，避免(miǎn)反復(fù)冷凍(dòng)。盡可能(néng)的(dí)不要(yào)使用溶(róng)血或高(gāo)血脂血。如果血(xiě)清中(zhōng)大(dà)量(liáng)顆(kē)粒(lì)，檢(jiǎn)測(cè)前先離心(xīn)或(huò)過濾。不要在(zài)37℃或更高的溫度加(jiā)熱解凍。應在室溫(wēn)下解凍並確保樣(yàng)品均匀(yún)地(dì)充分解凍(dòng)。

試劑(jì)的(dí)準備(bèi)
1． 標準品(pǐn)：標準(zhǔn)品(pǐn)的(dí)係列(liè)稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備(bèi)，不能儲存。稀釋(shì)前將標(biāo)準品(pǐn)振(zhèn)蕩混(hùn)匀(yún)。稀(xī)釋比(bǐ)例按下表中進行：
240 ng/ml （6號(hào)標(biāo)準品(pǐn)） 原倍濃度(dù)不用稀釋直(zhí)接(jiē)加(jiā)入50ul。
120 ng/ml （5號標(biāo)準品） 100ul的(dí)原(yuán)倍標(biāo)準品加入(rù)100ul的標準(zhǔn)品(pǐn)稀釋液(yè)
60 ng/ml （4號(hào)標準(zhǔn)品(pǐn)） 100ul的5號標準品加入(rù)100ul的標準品稀釋(shì)液
30 ng/ml （3號標(biāo)準品(pǐn)） 100ul的4號標準品加入100ul的標(biāo)準品稀釋液
15 ng/ml （2號標準品） 100ul的3號(hào)標(biāo)準品加入100ul的標(biāo)準品(pǐn)稀釋(shì)液(yè)
7.5 ng/ml （1號(hào)標準品） 100ul的2號標準品加(jiā)入(rù)100ul的(dí)標準品(pǐn)稀(xī)釋液(yè)
0 ng/ml （空(kōng)白對(duì)照） 原始濃(nóng)度不用(yòng)稀(xī)釋直(zhí)接加入50ul。

2． 洗滌(dí)緩衝(chōng)液(yè)（50×）的稀(xī)釋：蒸(zhēng)餾水50倍稀釋。

操作步(bù)驟
1． 使用(yòng)前(qián)，將所有(yǒu)試劑充分混(hùn)匀(yún)。不要(yào)使(shǐ)液體產生(shēng)大量的泡沫(mò)，以(yǐ)免加樣(yàng)時(shí)加入大(dà)量的(dí)氣(qì)泡(pào)，產生加樣(yàng)上(shàng)的(dí)誤(wù)差。
2． 根據(jù)待(dài)測樣(yàng)品數量加上標(biāo)準品(pǐn)的數量決(jué)定所(suǒ)需(xū)的板條(tiáo)數(shù)。每(měi)個(gè)標準品和(hé)空(kōng)白孔建(jiàn)議做復孔(kǒng)。每(měi)個樣(yàng)品(pǐn)根(gēn)據自己的數(shù)量來定(dìng)，能使(shǐ)用(yòng)復孔(kǒng)的盡量(liáng)做(zuò)復孔。
3． 加入稀(xī)釋(shì)好後的標準品50ul於反(fǎn)應孔，加入(rù)待(dài)測樣(yàng)品(pǐn)50ul於(yú)反應孔(kǒng)內(nèi)。立即加(jiā)入(rù)50ul的生物素(sù)標記(jì)的抗(kàng)體。蓋上(shàng)膜(mó)板，輕輕振蕩混匀(yún)，37℃溫育1小時(shí)。
4． 甩去(qù)孔內(nèi)液體，每(měi)孔(kǒng)加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去(qù)洗滌液，用吸水紙拍幹。重復(fù)此操作(zuò)3次(cì)。如(rú)果用(yòng)洗(xǐ)板機洗滌，洗(xǐ)滌次(cì)數(shù)增(zēng)加一次。
5． 每孔加入80ul的(dí)親和(hé)鏈(liàn)酶(méi)素-HRP，輕輕振蕩混匀，37℃溫(wēn)育(yù)30分(fēn)鐘。
6． 甩(shuǎi)去(qù)孔(kǒng)內(nèi)液體，每(měi)孔加(jiā)滿洗滌液，振(zhèn)蕩30秒，甩去洗滌液(yè)，用吸水紙(zhǐ)拍幹。重復此(cǐ)操作3次。如果用洗板機洗(xǐ)滌(dí)，洗(xǐ)滌次數增(zēng)加(jiā)一次。
7． 每孔加(jiā)入底(dǐ)物(wù)A，B各50ul，輕輕(qīng)振(zhèn)蕩(dàng)混匀(yún)，37℃溫育10分鐘(zhōng)。避免光(guāng)照(zhào)。
8． 取出酶標板(bǎn)，迅速(sù)加入50ul終止液(yè)，加(jiā)入(rù)終止液後(hòu)應立即(jí)測(cè)定(dìng)結(jié)果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值(zhí)。

建議使用的實驗方案(àn)
 標準品濃(nóng)度(dù)（ng/ml） 
A 240 240 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品
B 120 120 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品(pǐn)
C 60 60 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品
D 30 30 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品
E 15 15 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品
F 7.5 7.5 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品
G 0 0 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品
H 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品

局(jú)限
6號標準品(pǐn)以上的結果為非綫(xiàn)性(xìng)的，根據(jù)此標準(zhǔn)曲綫(xiàn)無法得到的結(jié)果。

試(shì)劑盒(hé)性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度(dù)小於1號標準(zhǔn)品。稀釋度(dù)的綫性(xìng)。樣(yàng)品綫性回歸與預期(qī)濃(nóng)度相關(guān)係數(shù)R值為0.990。
2. 特異性(xìng)：不與其它細(xì)胞因子(zǐ)反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內，板間變異係(xì)數(shù)均小於10%。

結 果 判 斷 與 分(fēn) 析(xī)
1，儀器值：於波長(cháng)450nm的(dí)酶(méi)標儀(yí)上讀取各孔(kǒng)的OD值(zhí)

2，以吸(xī)光度(dù)OD值(zhí)為(wéi)縱坐(zuò)標(biāo)（Y），相(xiāng)應(yīng)的E-selectin標(biāo)準(zhǔn)品濃度為(wéi)橫坐標（X），做(zuò)得(dé)相(xiāng)應的曲綫，樣品的E-selectin含量可根(gēn)據其OD值由(yóu)標準曲綫換(huàn)算出(chū)相(xiāng)應的(dí)濃度。

3，檢測值範(fàn)圍：0-240ng/ml

4，敏(mǐn)感(gǎn)度(dù)： 0.1 ng/ml