核酸(suān)分子(zǐ)雜交技術(shù)


這種技(jì)術是(shì)利(lì)用高(gāo)度特(tè)異性(xìng)以及(jí)檢(jiǎn)測(cè)方法的靈敏(mǐn)性，現(xiàn)在已(yǐ)經(jīng)成(chéng)為zui基(jī)本的(dí)技(jì)術了，現在已經被廣泛用(yòng)於基因(yīn)克隆了(liǎo)，酶(méi)切(qiē)圖譜的製作，基(jī)因序列的(dí)定(dìng)量(liáng)和定性(xìng)分析及基因(yīn)突(tū)變的檢(jiǎn)測等。其基(jī)本原理是具有一定(dìng)同源(yuán)性的(dí)原條核酸單(dān)鏈在(zài)一定的條(tiáo)件下(xià)（適(shì)宜的溫室度(dù)及離(lí)子強度等）可(kě)按鹼基互補原(yuán)成雙鏈(liàn)。雜(zá)交(jiāo)的雙(shuāng)方是待測(cè)核酸序(xù)列及(jí)探針（probe）,待(dài)測核(hé)酸序列(liè)可(kě)以是克隆(lóng)的基因征(zhēng)段(duàn)，也可(kě)以是(shì)未(wèi)克(kè)隆(lóng)化(huà)的基因(yīn)組(zǔ)DNA和(hé)細(xì)胞總RNA。核(hé)酸探針是(shì)指用(yòng)放射(shè)性核素，生(shēng)物素(sù)或其(qí)他活(huó)性(xìng)物質標(biāo)記的(dí)，能(néng)與特(tè)定的核(hé)酸序列發(fā)生特異性(xìng)互(hù)補的(dí)已(yǐ)知DNA或(huò)RNA片段。根據(jù)其來源和(hé)性質可分為cDNA探針，基因(yīn)組探針，寡核苷(gān)酸探針(zhēn)，RNA探(tàn)針(zhēn)等。


固相(xiāng)雜交


固(gù)相(xiāng)雜(zá)交(jiāo)（solid-phase hybridization）是將變(biàn)性的(dí)DNA固定於(yú)固(gù)體基質(zhì)（硝(xiāo)酸纖維素(sù)膜或(huò)尼(ní)龍濾膜(mó)）上(shàng)，再與(yǔ)探針(zhēn)進(jìn)行(háng)雜(zá)交，故也(yě)稱為(wéi)膜(mó)上印(yìn)跡(jì)雜(zá)交。


斑步雜交（dot hybridization）


是(shì)道先(xiān)將(jiāng)被(bèi)測的(dí)DNA或RNA變性後固(gù)定在(zài)濾膜上然(rán)後加(jiā)入過(guò)量的(dí)標(biāo)記(jì)好的DNA或RNA探針(zhēn)進行雜(zá)交。該(gāi)法的(dí)特點是(shì)操作簡單，事(shì)先(xiān)不(bù)用(yòng)限製性(xìng)內(nèi)切(qiē)酶消化或凝膠電永分離(lí)核酸(suān)樣(yàng)品，可在(zài)同(tóng)一張(zhāng)膜上(shàng)同時(shí)進行(háng)多(duō)個樣品的(dí)檢測;根(gēn)據(jù)斑點(diǎn)雜(zá)並(bìng)的(dí)結(jié)果，可以(yǐ)推算出雜交(jiāo)陽性的(dí)拷(kǎo)貝數(shù)。該法的缺點是(shì)不能鑒定(dìng)所(suǒ)測基因的(dí)相(xiāng)對(duì)分子(zǐ)質量(liáng)，而(ér)且特異(yì)性較差，有一定比(bǐ)例的假(jiǎ)陽性。


印跡(jì)雜交(jiāo)（blotting hybridization）


Southern印跡雜(zá)交(jiāo)：凝(níng)膠電離經限(xiàn)製(zhì)性內(nèi)切酶消化(huà)的(dí)DNA片段(duàn)，將凝(níng)膠(jiāo)上的(dí)DNA變(biàn)性(xìng)並在原位將單鏈(liàn)DNA片段轉(zhuǎn)移(yí)至硝(xiāo)基纖維(wéi)素(sù)膜或其(qí)他固相支(zhī)持物(wù)上(shàng)，經幹烤固(gù)定，再與相對(duì)應(yīng)結構的已標(biāo)記(jì)的探(tàn)針進(jìn)行那(nà)時交反應，用放(fàng)射(shè)性自(zì)顯影或酶反應顯(xiǎn)色，檢測(cè)特(tè)定(dìng)大(dà)小分(fēn)子的(dí)含量(liáng)。可進行克(kè)隆基(jī)因(yīn)的酶(méi)切(qiē)圖(tú)譜(pǔ)分析，基(jī)因(yīn)組(zǔ)基因(yīn)的定性及定量(liáng)分析(xī)，基因(yīn)突變(biàn)分析及(jí)限製性長(cháng)度(dù)多(duō)態(tài)性分(fēn)析（RELP）等(děng)。


Northern印跡(jì)雜交:由(yóu)Southerm印雜(zá)交法演(yǎn)變而來，其被測樣(yàng)品(pǐn)是(shì)RNA。經(jīng)甲醛(quán)或聚乙二醛變(biàn)性及電(diàn)泳分離(lí)後(hòu)，轉移到(dào)固相(xiāng)支持(chí)物(wù)上(shàng)，進(jìn)行雜交反應(yīng)，以鑒(jiàn)定基中特定(dìng)mRNA分子的量(liáng)與大小(xiǎo)。該法(fǎ)是(shì)研究基(jī)因(yīn)表達常(cháng)用的方法，可(kě)推(tuī)臬(niè)出癌基(jī)因(yīn)的表達程(chéng)度(dù)。


差(chà)異(yì)雜(zá)交(jiāo)（differential hybridization）


是將(jiāng)基(jī)因組(zǔ)文庫的重組(zǔ)噬菌(jūn)體DNA轉移至硝酸(suān)纖維(wéi)素膜上(shàng)，用(yòng)兩種混合(hé)的不同cDNA探針（如：轉移性和非轉(zhuǎn)移(yí)性癌組(zǔ)織(zhī)的(dí)mRNA逆(nì)轉(zhuǎn)錄後的(dí)cDNA）分(fēn)別(bié)與濾(lǜ)膜(mó)上的DNA雜交(jiāo)，分析(xī)兩張濾(lǜ)膜上(shàng)對(duì)應(yīng)位置雜交(jiāo)信(xìn)息以分離差(chà)異(yì)表(biǎo)達的基(jī)因(yīn)。適用於基因(yīn)組不太(tài)復雜的真(zhēn)核生物（如酵母(mǔ)）表(biǎo)達(dá)基因的比較(jiào)，假(jiǎ)陽性率(shuài)較低(dī)。但對基因組非常(cháng)復雜的鹽酸(suān)核生(shēng)物（如(rú)人(rén)），則因工(gōng)作量太大，表(biǎo)達的(dí)序(xù)列(liè)所占百分比較(jiào)低（僅(jǐn)5%左右），價值不大。


cDNA微(wēi)點(diǎn)隈雜交（cDNA microarray hybridization）


是(shì)指將cDNA克隆或(huò)cDNA的(dí)PCR產物以高度的(dí)列陣形式(shì)排布並(bìng)結(jié)合於(yú)固相支持(chí)物(wù)上(shàng)（如：尼龍膜(mó)或活化的(dí)載玻片）以(yǐ)微(wēi)點(diǎn)陣(zhèn)，然(rán)後用混(hùn)合的(dí)不(bù)同DNA探針(zhēn)與微(wēi)點(diǎn)陣上的DNA進行雜(zá)交。再利用(yòng)熒(yíng)光(guāng)，化學發光(guāng)，共聚焦顯(xiǎn)微鏡等技術(shù)掃描(miáo)微(wēi)點(diǎn)陣上的雜交信息。它(tā)比(bǐ)差(chà)異(yì)雜交技術的(dí)效率高，速度(dù)快，成(chéng)本低，適用(yòng)於大(dà)規模的分(fēn)析。已成商(shāng)品(pǐn)問(wèn)世。其缺(quē)點是無(wú)法(fǎ)克服保(bǎo)守(shǒu)的同源序列及重序(xù)對(duì)雜交信(xìn)息(xī)的(dí)幹擾。


寡(guǎ)核苷(gān)酸微點(diǎn)隈雜(zá)交（oligonucleotide microarray hybridization）


是(shì)在特殊(shū)的(dí)固(gù)相支(zhī)持(chí)物(wù)上原位合成(chéng)寡核(hé)苷酸，使(shǐ)它共(gòng)價(jià)結(jié)合(hé)於支持物表(biǎo)麵(miàn)，與平均長度為20-50nt的(dí)混合RNA或(huò)cDNA探(tàn)針進(jìn)行雜(zá)交(jiāo)，以(yǐ)提高(gāo)雜(zá)交的特異(yì)性和靈敏度(dù)。應(yīng)用共聚焦(jiāo)顯微(wēi)鏡可檢(jiǎn)測跨越(yuè)三個數(shù)量(liáng)級(jí)的(dí)雜交信息。適用於(yú)低(dī)豐度mRNA的檢(jiǎn)測(cè)，以(yǐ)區(qū)分基(jī)因家(jiā)族不同成員(yuán)的差異表達(dá)特征，或(huò)鑒定同(tóng)一轉錄(lù)在(zài)不同(tóng)組織(zhī)和細胞中的選擇性(xìng)剪接(jiē)。但有工作(zuò)量較(jiào)大，成本較高(gāo)，速度較慢(màn)等(děng)弱點。


液(yè)相(xiāng)雜交(jiāo)（solution hbridization）


指使(shǐ)變性的待(dài)測核酸(suān)單鏈與放射笥(sì)核(hé)素標記的已知的酸單鏈（探針）在溶(róng)液中保溫(wēn)，使之形(xíng)成(chéng)雜交(jiāo)復合物(wù)。反(fǎn)應結(jié)束後(hòu)，用羥磷灰石(shí)法(fǎ)或酶(méi)解(jiě)法(fǎ)將未被雜交的(dí)單鏈和雜(zá)交雙(shuāng)鏈(liàn)分(fēn)開(kāi)，然後結(jié)膈後在(zài)雜妝(zhuāng)分子中的(dí)探針量(liáng)，就可(kě)推(tuī)算出(chū)被(bèi)測的核酸量。


遞(dì)減雜交（subtractive hybridizatio）


是(shì)利(lì)用(yòng)兩種來(lái)源(yuán)一(yī)致而功(gōng)能(néng)不(bù)同的(dí)組(zǔ)織細胞提(tí)取(qǔ)mRNA（或(huò)逆轉(zhuǎn)錄成的(dí)cDNA）,在(zài)一定(dìng)的(dí)條件(jiàn)下以過(guò)量(liáng)的驅動mRNA或cDNA與(yǔ)測(cè)試的(dí)單鏈(liàn)cDNA或(huò)mRNA進(jìn)行(háng)液相雜(zá)交(jiāo)，通(tōng)過羥基(jī)磷灰石柱層析(xī)篩選除(chú)去(qù)兩者間(jiān)同源(yuán)的雜(zá)交(jiāo)體。經多輪(lún)雜交策(cè)選，除(chú)去兩者(zhě)之(zhī)間相同的基因成分，保留特異表達(dá)的(dí)目的(dí)基因或(huò)工基(jī)因(yīn)片段(duàn)。以(yǐ)後者(zhě)篩選cDNA文庫，可(kě)獲得特(tè)異(yì)表(biǎo)達的目(mù)的基(jī)因cDNA全長(cháng)序列。


核酸原位(wèi)雜交(jiāo)


用特(tè)定(dìng)標(biāo)記的已知(zhī)順序(xù)核酸(suān)作為探針(zhēn)與細胞級(jí)或(huò)組織(zhī)切(qiē)片(piàn)中核(hé)酸進(jìn)行(háng)復性(xìng)雜交並(bìng)對其實(shí)行檢測(cè)的方法，稱為(wéi)核酸原(yuán)位雜交（nucleic acid hybridization in situ）。用(yòng)來(lái)檢(jiǎn)測(cè)DNA在(zài)細(xì)胞(bāo)核或(huò)染色休(xiū)上的(dí)分(fēn)布，與細胞內(nèi)RNA進行雜(zá)交(jiāo)以研究(jiū)該組織(zhī)細胞中特定基因表達(dá)水(shuǐ)閏(rùn);還用(yòng)於細(xì)胞(bāo)，組織中有(yǒu)無(wú)特(tè)異性(xìng)菌，病毒(dú)檢測(cè)的(dí)研(yán)究。


該法的優點是(shì)特異性高(gāo)，可定(dìng)位;能在(zài)成(chéng)分(fēn)復(fù)雜的組(zǔ)織中進(jìn)行(háng)單一(yī)細胞的研(yán)究而不(bù)受同一(yī)組織中(zhōng)其(qí)他成分(fēn)的影響(xiǎng);不(bù)需(xū)要從組織(zhī)中提(tí)取(qǔ)核酸(suān)，對(duì)於組(zǔ)織中含(hán)量極(jí)低(dī)的(dí)靶序(xù)列(liè)有*的(dí)敏感性;並(bìng)可完(wán)整(zhěng)地(dì)保持(chí)組織與細(xì)胞(bāo)的(dí)形態(tài)。因此被(bèi)廣(guǎng)泛應(yīng)用於(yú)醫學生(shēng)物(wù)學的研究，如基(jī)因定位，基(jī)因(yīn)製失，基(jī)因易位(wèi)，特異基因整合部(bù)物色(sè)檢測等研究(jiū)。近年來由(yóu)定(dìng)性(xìng)發(fā)展(zhǎn)到(dào)定量，方(fāng)法更(gēng)為(wéi)*。


DNA分子克隆(lóng)技術（也(yě)稱基(jī)因克(kè)隆(lóng)技術）


在體外將DNA分(fēn)子片段與載體DNA片(piàn)段連接(jiē)，轉(zhuǎn)入(rù)細(xì)胞獲得(dé)大量(liáng)拷(kǎo)貝的過程中(zhōng)DNA分(fēn)子克隆（或(huò)基(jī)因克隆(lóng)）。其基(jī)本(běn)步驟(zhòu)包(bāo)括(kuò)：製(zhì)備目(mù)的基因(yīn)→將目的(dí)基因與(yǔ)載體(tǐ)用(yòng)限製性(xìng)內(nèi)切酶切割(gē)和連(lián)接(jiē)，製(zhì)成DNA重組(zǔ)→導(dǎo)入宿主(zhǔ)細(xì)胞→篩(shāi)選(xuǎn)，鑒定→擴增和表達(dá)。載體(tǐ)（vecors）在細胞(bāo)內自我復製，並帶動重組的(dí)分子(zǐ)片段(duàn)共(gòng)同增(zēng)殖，從而產生(shēng)大量的(dí)DNA分(fēn)子片段(duàn)。主要目的(dí)是獲得(dé)某(mǒu)一基(jī)因或NDA片段的大量拷貝，有了這些(xiē)與(yǔ)親(qīn)本分子*相(xiāng)同的(dí)分(fēn)子(zǐ)克隆，就(jiù)可(kě)以深入分(fēn)析(xī)基因的結(jié)構(gòu)與功(gōng)能，隨(suí)著(zhuó)引(yǐn)入(rù)的DNA片(piàn)段不同，有(yǒu)兩種DNA庫，一種(zhǒng)是基(jī)因組文(wén)庫（genomic library）,另一(yī)種是cDNA庫(kù)。


載體：所(suǒ)謂載(zǎi)體(tǐ)是指攜帶靶DNA片段進入宿主(zhǔ)細胞進行(háng)擴(kuò)增和表(biǎo)達的工具。

    上海艾研生物科技有限公司：http://hfqingxin.cn/