1，Sephadex LH-20的步驟。
（1） 選擇條(tiáo)件：
梯(tī)度洗脫(tuō)在Sephadex使用(yòng)中(zhōng)並(bìng)不象在正相柱(zhù)層(céng)析中(zhōng)那麼重要。首先你的(dí)樣(yàng)品須要能溶解在盡(jìn)量少(shǎo)量的(dí)洗脫(tuō)劑(jì)中。極(jí)性(xìng)在的用(yòng)甲醇(chún)水係統(tǒng);極(jí)性(xìng)小(xiǎo)者一般用不含水的(dí)係(xì)統。我(wǒ)們(mén)實驗室(shì)常(cháng)用(yòng)正己烷二(èr)氯(lǜ)甲烷甲醇係統，用(yòng)了(liǎo)很多年，效果較好(hǎo)。
（2） 飽和(hé)層析柱(zhù)：
用洗(xǐ)脫(tuō)劑(jì)將凝膠(jiāo)搖匀(yún)，直立(lì)柱(zhù)身(shēn)，讓(ràng)其自然沉(chén)降，此時(shí)要防(fáng)止(zhǐ)氣泡留在(zài)其(qí)中。至(zhì)少半小時打(dǎ)開開關，流出幾(jī)個柱(zhù)體(tǐ)種的洗(xǐ)脫(tuō)劑(jì)，目的是使(shǐ)其膨脹(zhàng)在(zài)正確(què)比(bǐ)例(lì)的(dí)洗脫劑(jì)中。
（3） 樣品(pǐn)處理：用(yòng)盡量少(shǎo)的洗(xǐ)脫劑(jì)溶(róng)解樣品，常(cháng)壓(yā)過濾。
（4） 濕(shī)法(fǎ)上(shàng)柱。這也(yě)是要有技巧的(dí)步驟。
（5） 洗(xǐ)脫：控製(zhì)流(liú)速，一般1drop/s以(yǐ)下，可參(cān)見(jiàn)廠(chǎng)家的一些(xiē)參數;必要時(shí)更改極(jí)性（很(hěn)多時一(yī)個極(jí)性(xìng)就可(kě)以將樣(yàng)品(pǐn)洗脫完畢(bì)）。
再生以(yǐ)備(bèi)下(xià)次使用。
 2 Sephadex LH20 的(dí)原理(lǐ)。
Sephadex LH20的分離原理(lǐ)主要有兩方麵(miàn)：以凝膠過濾作(zuò)用為主，兼具反相(xiāng)分(fēn)配(pèi)的作(zuò)用（在反(fǎn)相(xiāng)溶(róng)劑中）。因(yīn)為凝膠過濾作用(yòng)，所以大分(fēn)子的化合物保留(liú)弱，先(xiān)被洗(xǐ)脫(tuō)下(xià)來，小(xiǎo)分子的化合物(wù)保留強(qiáng)，zui後出柱。如(rú)果使用反相(xiāng)溶(róng)劑洗脫(tuō)， Sephadex LH20對(duì)化合物(wù)還起反(fǎn)相分配的(dí)作(zuò)用(yòng)，所以(yǐ)極(jí)性大的化(huà)合物保(bǎo)留弱(ruò)，先(xiān)被(bèi)洗(xǐ)脫下(xià)來(lái)，極性小的化(huà)合物保留強，後出(chū)柱(zhù)。如果(guǒ)使(shǐ)用正相(xiāng)溶劑(jì)洗脫，這(zhè)主(zhǔ)要(yào)靠凝膠過濾(lǜ)作用來(lái)分(fēn)離。
 3 Sephadex LH20 洗(xǐ)脫(tuō)溶劑。
看完(wán)第2點後，就應該清(qīng)楚(chǔ)Sephadex LH20 洗脫溶(róng)劑因分為兩類：反(fǎn)相和正(zhèng)相兩種。用得(dé)zui多(duō)的(dí)是反(fǎn)相溶(róng)劑洗(xǐ)脫(tuō)，以(yǐ)甲醇--水係統(tǒng)zui為常(cháng)見，先用水(shuǐ)，逐漸(jiàn)增加甲醇比例(lì)，zui後用(yòng)100％甲醇衝(chōng)柱。正相係(xì)統(tǒng)以(yǐ)氯(lǜ)仿--甲醇zui為常見(jiàn)，先(xiān)用(yòng)50％氯仿--甲醇，逐漸(jiàn)增加甲醇(chún)比(bǐ)例(lì)，zui後用100％甲(jiǎ)醇(chún)衝柱(zhù)。
   4 Sephadex LH20 樣(yàng)品的(dí)處理(lǐ)和(hé)洗脫(tuō)溶劑的選(xuǎn)擇。
如果(guǒ)樣品(pǐn)極(jí)性大，這(zhè)選(xuǎn)用(yòng)反相溶(róng)劑(jì)洗(xǐ)脫(tuō)（甲醇(chún)--水），樣(yàng)品(pǐn)用zui少(shǎo)體(tǐ)積的甲醇--水（盡(jìn)可能甲醇少一(yī)些(xiē)）溶(róng)解(jiě)，過(guò)濾後，濕法(fǎ)上樣(yàng)（一定要(yào)濾喔！要(yào)是把Sephadex LH20 堵啦，就(jiù)得(dé)將Sephadex LH20 的(dí)柱頭(tóu)部分棄去，很(hěn)心痛(tòng)呀）。如(rú)果樣品(pǐn)極(jí)性小(xiǎo)，這選(xuǎn)用(yòng)正相溶(róng)劑洗(xǐ)脫（氯仿--甲醇），樣品(pǐn)用zui少體積的氯仿--甲醇(chún)溶解(jiě)，過濾後，濕法(fǎ)上(shàng)樣(yàng)。
1 Sephadex G型葡(pú)聚糖凝(níng)膠隻適合(hé)在水中使用，Sephadex G-25羥丙(bǐng)化(huà)後(hòu)就是(shì)Sephadex LH-20。其既(jì)有分(fēn)子篩作用，在由(yóu)極(jí)性與非極(jí)性溶(róng)劑組(zǔ)成的溶(róng)劑中(zhōng)還(huán)有反(fǎn)相層(céng)析(xī)效(xiào)果。雖(suī)然價位很高，但由於性能(néng)頗(pō)佳(jiā)，可(kě)再生利(lì)用，所(suǒ)以(yǐ)倍(bèi)受親(qīn)睞。此外上柱(zhù)樣品損失很少，對處(chǔ)理(lǐ)小(xiǎo)樣(yàng)品較好，這也是(shì)我們實驗(yàn)室常用的(dí)原(yuán)因(yīn)之(zhī)一。
 6 分離(lí)的技巧，zui後說說我的(dí)使(shǐ)用心得
（1） 流速不可(kě)太(tài)快，切(qiē)切不可新(xīn)急(jí)，所(suǒ)謂欲速則(zé)不達。
（2）柱子(zǐ)盡可(kě)能(néng)長， Sephadex LH20 柱長(cháng)的(dí)增(zēng)加將極(jí)大地(dì)改善(shàn)分(fēn)離(lí)，所不(bù)要(yào)吝(lìn)惜填料，寧可將填料全(quán)裝在一(yī)根大柱子中，不(bù)要將(jiāng)填料(liào)裝成幾根(gēn)小(xiǎo)柱。所謂集中(zhōng)優勢(shì)兵力(lì)，打擊(jī)敵人。
（3） 餾分(fēn)一定要(yào)接的細(xì)，可(kě)1／10，或1／20 個保留體(tǐ)積接成一(yī)餾分。
（4） 洗(xǐ)脫體積(jī)一般為(wéi)2-3個(gè)保留體(tǐ)積，對特殊(shū)保留(liú)強(qiáng)的化(huà)合物，可(kě)洗脫5個保留(liú)體積(jī)。
（5）鞣(róu)質(zhì)成(chéng)分(fēn)死吸附(fù)嚴重，如不(bù)在(zài)乎(hū)填料(liào)者，可用Sephadex LH20 分鞣質
（6）Sephadex LH20 對黃(huáng)酮(tóng)類成分的分(fēn)離效(xiào)果，方法(fǎ)很成型(xíng)，有大(dà)量文獻(xiàn)參(cān)考。
（7）填(tián)料(liào)反復使用，每次(cì)用完，一(yī)般可用(yòng)甲醇將(jiāng)柱(zhù)子洗幹(gān)淨(jìng)，然後用(yòng)下一次分(fēn)離的起(qǐ)步(bù)溶劑(jì)將(jiāng)甲(jiǎ)醇(chún)替(tì)換出來，待(dài)用。

   Sephadex LH-20是由(yóu)葡聚(jù)糖G-25羥(qiǎng)丙基(jī)化加(jiā)工而(ér)成(chéng)，屬(shǔ)於分子(zǐ)篩凝(níng)膠，尤其適(shì)用於天(tiān)然產物在有(yǒu)機(jī)溶劑(jì)中的純化(huà)。例(lì)如：類(lèi)固醇(chún)，萜類，脂類以(yǐ)及(jí)小分子多肽等(děng)，Pharmadex LH-20同時(shí)適用(yòng)於分子(zǐ)類別非(fēi)常(cháng)相似的(dí)物(wù)質的(dí)分(fēn)離和工業(yè)規模(mó)的製(zhì)備，既可(kě)用(yòng)於(yú)初(chū)步(bù)純化步驟，也可用(yòng)於zui終精製步驟，如非對映同(tóng)分異(yì)構體的(dí)分離(lí)。
   1.裝柱
裝填的重要(yào)原則(zé)之一就是需要形成(chéng)一個穩(wěn)定(dìng)均一(yī)的柱床。膠顆粒越均一(yī)（粒徑分布越窄(zhǎi)），越容易獲(huò)得穩定均(jūn)一的(dí)柱(zhù)床。但是(shì)對於Sephadex LH-20而(ér)言，25～100μm的粒徑範圍(wéi)相(xiāng)對於許多(duō)用於製備(bèi)色譜的(dí)填(tián)料(liào)而言，不(bù)能說分(fēn)布(bù)均一，也(yě)就是說(shuō)其(qí)粒徑分布較寬。然(rán)而(ér)當(dāng)膠(jiāo)溶(róng)脹(zhàng)後(hòu)就相對容易(yì)得到(dào)均一的柱床(chuáng)。這(zhè)對於長柱（zui高至250cm）而(ér)言(yán)也是同樣的(dí)。在裝柱前，層(céng)析柱(zhù)和(hé)儲(chǔ)槽都(dū)必須進行*的(dí)清(qīng)洗。
Sephadex LH-20在(zài)使(shǐ)用之(zhī)前(qián)必須(xū)進行(háng)溶脹(zhàng)。在(zài)溶(róng)脹的過(guò)程(chéng)中(zhōng)，要(yào)盡(jìn)量(liáng)避(bì)免(miǎn)過分攪拌(bàn)，否(fǒu)則(zé)會(huì)破(pò)壞球形(xíng)膠(jiāo)粒，且要避(bì)免(miǎn)使用磁力攪拌(bàn)器(qì)。
在室(shì)溫下，將凝膠溶脹於(yú)層析溶劑(jì)中至少三(sān)小時，溶(róng)脹後膠體積的(dí)大小(xiǎo)決(jué)定於所使(shǐ)用的(dí)溶劑(jì)係統，請參考(kǎo)後頁(yè)之幹(gān)膠溶脹表計算特(tè)定(dìng)柱體積(jī)所(suǒ)需要(yào)幹膠的(dí)量(liáng)。使溶脹膠(jiāo)體積沉(chén)澱之(zhī)後(hòu)占(zhān)總(zǒng)體積的(dí)75%，上(shàng)層(céng)溶劑(jì)占25%，這時(shí)，懸浮液從一(yī)個容器倒(dǎo)入(rù)另一(yī)容器(qì)時(shí)膠粒可(kě)移(yí)動。將(jiāng)溶(róng)脹(zhàng)後(hòu)的凝(níng)膠(jiāo)根(gēn)據裝柱要求均(jūn)匀倒(dǎo)入柱內，在(zài)保證膠(jiāo)粒(lì)不變形(xíng)的前(qián)提下(xià)，應在(zài)盡可能高的(dí)壓(yā)力下裝(zhuāng)柱(zhù)，反壓不要超(chāo)過(guò)1.5ba。
    2.平衡
上樣(yàng)前(qián)，用洗(xǐ)脫(tuō)液平衡層析(xī)柱至少兩(liǎng)個柱(zhù)體(tǐ)積直到(dào)基(jī)綫(xiàn)變得(dé)平(píng)穩為止(zhǐ)，如改變(biàn)溶劑應該注意(yì)凝(níng)膠(jiāo)在新(xīn)溶劑中(zhōng)的溶脹(zhàng)性質(zhì)，並(bìng)根據(jù)性質確(què)定(dìng)柱高(gāo)調(tiáo)節(jié)器的位置，如使(shǐ)用相同的溶(róng)劑(jì)，在(zài)以後(hòu)的(dí)層析(xī)中(zhōng)柱(zhù)平衡可(kě)以(yǐ)省略(lüè)。
    3.洗(xǐ)脫(tuō)液(yè)
為確(què)保(bǎo)延長(cháng)層析柱(zhù)的(dí)使用壽命，所(suǒ)有(yǒu)的緩衝液(yè)都(dū)應該離(lí)心或經過0.45um的膜過濾(lǜ)以(yǐ)除(chú)去雜(zá)質(zhì)。
    4.樣(yàng)品(pǐn)
樣品體(tǐ)積應(yīng)該占(zhān)柱總體(tǐ)積(jī)的1-2%，同(tóng)樣在(zài)使用之(zhī)前(qián)樣品應該離(lí)心(xīn)或經(jīng)過(guò)0.45um的(dí)膜過濾。
    5.洗(xǐ)脫
洗脫流速(sù)應根據(jù)情(qíng)況(kuàng)而(ér)定，zui大綫性(xìng)流速約12cm/min（反壓1.5ba），建(jiàn)議(yì)流速(sù)為1-10cm/h。總(zǒng)體(tǐ)來說(shuō)，較低(dī)的(dí)流(liú)速，具有(yǒu)較(jiào)高的分辯率。
    6.再生
凝膠(jiāo)再生(shēng)通常是先用(yòng)2-3個(gè)柱體積的(dí)洗(xǐ)脫液(yè)進(jìn)行清洗，如(rú)更換洗脫液(yè)，則需要重(zhòng)新平衡(héng)。
    7.體積(jī)流速與(yǔ)綫性流速的關係(xì)
綫性流(liú)速=體積流速(sù)/橫截(jié)麵(miàn)積(jī)
    8.溶(róng)脹體(tǐ)積
由於Sephadex LH-20的溶(róng)脹體積依(yī)賴(lài)於溶劑(jì)，所以(yǐ)對(duì)於不(bù)同直徑的(dí)柱(zhù)可根據比例增加或減(jiǎn)少舊柱體積(jī)以(yǐ)便計算出新(xīn)體(tǐ)積。
新體(tǐ)積(jī)=舊體積×（新柱(zhù)體(tǐ)積/舊柱體積）
    9.膠的性(xìng)質
Sephadex LH-20同時具備(bèi)親(qīn)水和(hé)親(qīn)脂雙(shuāng)重(zhòng)性質，且被(bèi)分(fēn)離(lí)物(wù)質的(dí)極性(xìng)在分離(lí)過程中(zhōng)起(qǐ)著重要(yào)作(zuò)用(yòng)。
    10.排阻(zǔ)極限(xiàn) 4-5KD（與所(suǒ)用溶劑有關(guān)）
    11.上(shàng)樣量(liáng)
吸附(fù)模式 取決於所需分辯率
分(fēn)子(zǐ)量(liáng)大小 小(xiǎo)於總體(tǐ)積的20%
正相(xiāng)分(fēn)配 小於(yú)總體(tǐ)積的(dí)1%
    12.其(qí)他
膠粒(lì)形狀 球(qiú)形，多(duō)孔
顆(kē)粒大(dà)小（幹(gān)） 18-111um（直(zhí)徑(jìng)）
顆粒(lì)大(dà)小中間(jiān)值(zhí)（幹） 70um（直徑）
顆(kē)粒大(dà)小（甲(jiǎ)醇） 27-163 um（直徑(jìng)）
顆粒(lì)大小中間(jiān)值（甲醇） 103 um（直(zhí)徑）
zui大(dà)綫(xiàn)性(xìng)流(liú)速 720cm/min
參考綫(xiàn)性(xìng)流(liú)速(sù) 60 cm/min
pH的(dí)穩(wěn)定(dìng)性(xìng)
操作(zuò)中(zhōng) 2-11
清洗中 2-13
化(huà)學穩定(dìng)性 在(zài)許(xǔ)多水溶液及有機溶劑(jì)係統(tǒng)中都穩(wěn)定。在(zài)pH2以(yǐ)下(xià)或強氧化(huà)劑中(zhōng)不穩定
高壓(yā)滅(miè)菌 121℃可(kě)忍受20分種(zhǒng)
操(cāo)作溫度 4℃到40℃
保存(cún)條件
新(xīn)填料(liào) 4-25℃（幹燥(zào)）
使(shǐ)用(yòng)後填(tián)料(liào) 4-8℃，pH6-8，切勿冷(lěng)凍(dòng)，加(jiā)入(rù)抑(yì)菌(jūn)劑（如(rú)20%乙醇，0.04%疊氮鈉）
    13.幹膠(jiāo)溶脹表
溶劑(jì) 床(chuáng)體(tǐ)積（mL凝(níng)膠/g幹膠(jiāo)粉(fěn)末）
Dimethyl sulphoxide 二(èr)甲(jiǎ)亞碸 4.4～4.6
Pyridine 嘧啶 4.2～4.4
Water 水(shuǐ) 4.0～4.4
Dimethylformamide 二甲基甲(jiǎ)酰胺 3.8～4.2
Saline 生理(lǐ)鹽(yán)水(shuǐ) 3.9～4.1
Methanol 甲(jiǎ)醇 3.8～4.1
Methane dichloride 二氯乙烷 3.8～4.1
Chloroform* 氯仿(fǎng) 3.8～4.1
Propanol 丙(bǐng)醇 3.7～4.0
Ethanol** 乙醇 3.6～3.9
Isobutanol 異(yì)丁醇(chún) 3.6～3.9
Formamide 甲酰胺 3.6～3.9
Methylene dichloride 二(èr)氯甲(jiǎ)烷 3.6～3.9
Butanol 丁醇 3.5～3.8
Isopropanol 異(yì)丙醇(chún) 3.3～3.6
Tetrahydrofuran * 3.3～3.6
Dioxane 二(èr)氧雜(zá)環(huán)已烷(wán) 3.2～3.5
Acetone 丙(bǐng)酮 2.4～2.6
Acetonitrile*** 乙(yǐ)腈 2.2～2.4
Carbon tetrachloride 四氯化碳(tàn) 1.8～2.2
Benzene 苯(běn) 1.6～2.0
Ethyl acetate 乙(yǐ)酸乙酯(zhǐ) 1.6～1.8
Toluene 甲苯(běn) 1.5～1.6