試驗(yàn)原理：
cGMP試(shì)劑(jì)盒是固相夾(jiā)心(xīn)法酶聯免(miǎn)疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已(yǐ)知cGMP濃度(dù)的(dí)標準品(pǐn)，未(wèi)知(zhī)濃(nóng)度的樣品(pǐn)加入微(wēi)孔酶(méi)標板內進行檢測(cè)。先(xiān)將cGMP和生物(wù)素(sù)標記(jì)的抗體(tǐ)同(tóng)時(shí)溫(wēn)育。洗滌(dí)後(hòu)，加入親和(hé)素標(biāo)記(jì)過的HRP。再經過溫(wēn)育和洗滌，去除未結合(hé)的酶結合物(wù)，然後(hòu)加入底(dǐ)物A，B，和酶結合物(wù)同時作用(yòng)。產生顏色(sè)。顏(yán)色的(dí)深淺和(hé)樣品中cGMP的濃(nóng)度呈(chéng)比(bǐ)例(lì)關(guān)係。

試(shì)劑(jì)盒內(nèi)容及其配製
試劑盒(hé)成份（2-8℃保存(cún)） 96孔配置(zhì) 48孔配置 配(pèi)製(zhì)
96/48人份酶標板 1塊板(bǎn)（96T） 半(bàn)塊(kuài)板(bǎn)（48T） 即用(yòng)型(xíng)
塑(sù)料(liào)膜(mó)板蓋 1塊(kuài) 半塊 即(jí)用型
標準品(pǐn)：800pmol/L 1瓶（0.6ml） 1瓶(píng)（0.3ml） 按說(shuō)明(míng)書進(jìn)行稀稀
空(kōng)白對(duì)照(zhào) 1瓶(píng)（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即(jí)用型(xíng)
標(biāo)準品稀釋(shì)緩衝液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用(yòng)型
生物素標(biāo)記的(dí)抗cGMP抗(kàng)體(tǐ) 1瓶（6ml） 1瓶(píng)（3.0ml） 即用(yòng)型
親和鏈酶(méi)素-HRP 1瓶(píng)（10ml） 1瓶（5.0ml） 即用型(xíng)
洗滌緩(huǎn)衝液 1瓶(píng)（20ml） 1瓶（10ml） 按(àn)說明書(shū)進(jìn)行稀釋
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型
底(dǐ)物B 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用型
終(zhōng)止液(yè) 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用(yòng)型(xíng)

自備材料(liào)
1． 蒸餾水。
2． 加(jiā)樣器：5ul，10ul，50ul，100ul，200，500ul，1000ul。
3． 振蕩器及磁力攪拌器等(děng)。

安(ān)全性(xìng)
1． 避(bì)免直(zhí)接接觸(chù)終止液和(hé)底(dǐ)物(wù)A，B。一旦接(jiē)觸(chù)到這些(xiē)液(yè)體(tǐ)，請(qǐng)盡快用水衝洗(xǐ)。
2． 實(shí)驗中不要(yào)吃喝，抽煙或使用化(huà)妝品。
3． 不要用(yòng)嘴(zuǐ)吸取試劑盒裏(lǐ)的任(rèn)何成份(fèn)。

操(cāo)作注(zhù)意事(shì)項(xiàng)
1． 試(shì)劑(jì)應(yīng)按標(biāo)簽(qiān)說明書儲存(cún)，使用前恢復(fù)到(dào)室溫(wēn)。稀稀(xī)過(guò)後的標(biāo)準(zhǔn)品應丟(diū)棄(qì)，不(bù)可(kě)保存(cún)。
2． 實驗中不(bù)用(yòng)的(dí)板條(tiáo)應(yīng)立即放(fàng)回包(bāo)裝袋中，密封保存(cún)，以(yǐ)免(miǎn)變質。
3． 不用(yòng)的(dí)其(qí)它試劑(jì)應包裝好或蓋好(hǎo)。不(bù)同批號(hào)的(dí)試劑不(bù)要(yào)混用。保質前使(shǐ)用。
4． 使(shǐ)用一(yī)次(cì)性(xìng)的(dí)吸頭(tóu)以免交叉(chā)汙(wū)染，吸(xī)取(qǔ)終(zhōng)止(zhǐ)液和底物A，B液(yè)時，避(bì)免(miǎn)使用帶(dài)金屬(shǔ)部(bù)分(fēn)的加(jiā)樣(yàng)器(qì)。
5． 使(shǐ)用幹(gān)淨的塑料容器(qì)配置(zhì)洗(xǐ)滌液(yè)。使(shǐ)用(yòng)前(qián)充(chōng)分(fēn)混匀(yún)試(shì)劑(jì)盒裏的各種成份及(jí)樣品。
6． 洗(xǐ)滌酶標(biāo)板(bǎn)時應充分(fēn)拍幹，不要(yào)將(jiāng)吸水紙(zhǐ)直接放(fàng)入(rù)酶標(biāo)反應孔中吸水(shuǐ)。
7． 底物A應(yīng)揮(huī)發，避免(miǎn)長時間打開(kāi)蓋子。底物B對光敏感(gǎn)，避免長時間(jiān)暴(bào)露(lòu)於(yú)光下。避(bì)免用手(shǒu)接觸(chù)，有(yǒu)毒(dú)。實驗完(wán)成後(hòu)應(yīng)立即讀(dú)取(qǔ)OD值。
8． 加入試劑的順(shùn)序應一致，以保證(zhèng)所有反應板孔溫育的(dí)時(shí)間一(yī)樣。
9． 按照說明(míng)書(shū)中(zhōng)標(biāo)明(míng)的時(shí)間(jiān)，加液的量及(jí)順(shùn)序進(jìn)行(háng)溫育操作(zuò)。

樣品收(shōu)集，處理及保(bǎo)存(cún)方法(fǎ)
1， 血清-----操作過程中避免(miǎn)任(rèn)何細(xì)胞(bāo)刺(cì)激。使用不含熱(rè)原(yuán)和內毒素的試管(guǎn)。收集(jí)血(xiě)液(yè)後(hòu)，1000×g離(lí)心10分鐘將血(xiě)清(qīng)和紅細胞迅(xùn)速小心地(dì)分(fēn)離。
2， 血漿-----EDTA，檸檬酸(suān)鹽，肝素血漿(jiāng)可(kě)用(yòng)於(yú)檢(jiǎn)測(cè)。1000×g離心(xīn)30分鐘(zhōng)去除(chú)顆(kē)粒。
3， 細(xì)胞(bāo)上清液---1000×g離心(xīn)10分(fēn)鐘(zhōng)去(qù)除顆(kē)粒和聚合物。
4， 保存(cún)------如(rú)果(guǒ)樣品不(bù)立(lì)即(jí)使(shǐ)用(yòng)，應將其(qí)分成小(xiǎo)部分(fēn)-70 ℃保(bǎo)存，避免反復冷(lěng)凍(dòng)。盡可(kě)能的不(bù)要(yào)使用(yòng)溶血或高血脂血(xiě)。如(rú)果血清(qīng)中大量顆粒，檢測前先(xiān)離(lí)心或過(guò)濾。不要在37℃或(huò)更高(gāo)的溫度加熱解(jiě)凍。應(yīng)在室溫下解凍並確(què)保(bǎo)樣(yàng)品均匀地充分解(jiě)凍。

試劑的準(zhǔn)備(bèi)
1． 標準品：標(biāo)準品的(dí)係列稀釋應(yīng)在(zài)實驗時準(zhǔn)備，不(bù)能儲存(cún)。稀(xī)釋前將(jiāng)標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混匀(yún)。稀(xī)釋比(bǐ)例按(àn)下(xià)表(biǎo)中(zhōng)進(jìn)行：
800 pmol/L （6號(hào)標準(zhǔn)品） 原倍濃(nóng)度不用稀(xī)釋(shì)直接加入(rù)50ul。
400 pmol/L （5號標準品） 100ul的原(yuán)倍(bèi)標準(zhǔn)品加(jiā)入100ul的(dí)標準品稀(xī)釋液
200 pmol/L （4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀(xī)釋(shì)液(yè)
100 pmol/L （3號(hào)標(biāo)準品） 100ul的(dí)4號標準(zhǔn)品加(jiā)入(rù)100ul的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50 pmol/L （2號標(biāo)準品(pǐn)） 100ul的3號標(biāo)準品(pǐn)加(jiā)入(rù)100ul的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)稀(xī)釋液
25 pmol/L （1號標(biāo)準品） 100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)加入(rù)100ul的(dí)標準品稀釋液(yè)
0 pmol/L （空白(bái)對照） 原始濃(nóng)度不用稀(xī)釋直接加入50ul。

2． 洗(xǐ)滌緩(huǎn)衝液（50×）的稀(xī)釋：蒸餾水(shuǐ)50倍(bèi)稀釋(shì)。

操(cāo)作(zuò)步(bù)驟
1． 使用(yòng)前(qián)，將所(suǒ)有試劑(jì)充(chōng)分(fēn)混匀。不(bù)要(yào)使(shǐ)液體產生大量(liáng)的泡沫(mò)，以免加(jiā)樣(yàng)時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣(yàng)上的(dí)誤差(chà)。
2． 根(gēn)據(jù)待測樣(yàng)品(pǐn)數(shù)量(liáng)加上(shàng)標(biāo)準品的(dí)數(shù)量(liáng)決定(dìng)所(suǒ)需(xū)的(dí)板條數。每(měi)個(gè)標準品和空白孔建議做(zuò)復(fù)孔。每個(gè)樣(yàng)品根(gēn)據(jù)自己的(dí)數量(liáng)來定(dìng)，能(néng)使(shǐ)用復(fù)孔(kǒng)的盡(jìn)量做復(fù)孔(kǒng)。
3． 加入稀釋好(hǎo)後(hòu)的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品50ul於反(fǎn)應孔(kǒng)，加入(rù)待測樣品50ul於(yú)反(fǎn)應孔內。立即加(jiā)入50ul的(dí)生物素標記的抗(kàng)體(tǐ)。蓋上(shàng)膜板，輕(qīng)輕振(zhèn)蕩混匀(yún)，37℃溫育(yù)1小時(shí)。
4． 甩去孔(kǒng)內液體，每孔加滿洗(xǐ)滌液(yè)，振(zhèn)蕩30秒(miǎo)，甩去洗(xǐ)滌(dí)液，用(yòng)吸(xī)水(shuǐ)紙拍幹(gān)。重復此(cǐ)操作3次。如(rú)果用(yòng)洗板機(jī)洗滌，洗滌次(cì)數(shù)增加(jiā)一次。
5． 每孔加入80ul的(dí)親和(hé)鏈(liàn)酶素-HRP，輕輕振蕩混匀(yún)，37℃溫育(yù)30分(fēn)鐘。
6． 甩(shuǎi)去(qù)孔(kǒng)內液體，每孔加(jiā)滿洗滌液，振蕩(dàng)30秒(miǎo)，甩去洗滌(dí)液，用吸水(shuǐ)紙拍(pāi)幹(gān)。重復此(cǐ)操作(zuò)3次。如(rú)果用洗板(bǎn)機洗滌(dí)，洗滌次(cì)數增(zēng)加(jiā)一次。
7． 每(měi)孔(kǒng)加入(rù)底物A，B各(gè)50ul，輕輕振蕩(dàng)混匀(yún)，37℃溫(wēn)育10分(fēn)鐘(zhōng)。避免(miǎn)光照。
8． 取出酶標板(bǎn)，迅(xùn)速加入50ul終(zhōng)止液(yè)，加(jiā)入(rù)終(zhōng)止液(yè)後應立即測(cè)定結果。
9． 在450nm波長處(chǔ)測定(dìng)各(gè)孔的(dí)OD值(zhí)。

建(jiàn)議使用的(dí)實驗方案
 標(biāo)準品濃度(dù)（pmol/L） 
A 800 800 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn)
B 400 400 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品
C 200 200 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品
D 100 100 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品
E 50 50 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品
F 25 25 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn)
G 0 0 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品
H 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品

局(jú)限
6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上(shàng)的結(jié)果(guǒ)為非綫性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲(qū)綫無(wú)法得到的結果(guǒ)。

試劑盒(hé)性(xìng)能(néng)
1. 靈敏度：zui小的(dí)檢測濃(nóng)度小於(yú)1號(hào)標準(zhǔn)品(pǐn)。稀釋度的(dí)綫(xiàn)性。樣品(pǐn)綫性回(huí)歸與預期濃(nóng)度相(xiāng)關(guān)係數R值(zhí)為0.990。
2. 特異(yì)性(xìng)：不(bù)與其它(tā)細胞因(yīn)子反應。
3. 重(zhòng)復性：板內，板間變異係(xì)數均小於(yú)10%。

結 果(guǒ) 判(pàn) 斷 與(yǔ) 分 析
1，儀(yí)器值(zhí)：於(yú)波(bō)長450nm的(dí)酶標儀(yí)上讀(dú)取各孔(kǒng)的OD值

2，以(yǐ)吸(xī)光(guāng)度OD值為縱(zòng)坐標（Y），相應(yīng)的(dí)cGMP標(biāo)準品(pǐn)濃度為橫坐標（X），做得相(xiāng)應的曲(qū)綫，樣(yàng)品(pǐn)的cGMP含(hán)量可(kě)根(gēn)據其(qí)OD值由標準(zhǔn)曲綫(xiàn)換(huàn)算出(chū)相(xiāng)應的(dí)濃度(dù)。

3，檢測值範圍：0-800pmol/L

4，敏感度： 1.0 pmol/L